草原红牛微卫星DNA群体遗传变异分析研究杨国忠1,任文陟2,张嘉保"(1•河北北方学院牧工系，河北张家口075131;2中国人民解放军军需大学军事兽医系，吉林长春130062)：S823.8文献标识码：B：10047034(2005)002002对于动物而言，遗传多样性一般指品种内个体在DNA水平上千差万别。通过对群体遗传变异进行分析研究，可以了解品种的遗传结构、生活背景，分析其进化历史，探讨品种濒危的原因和现状，提出合理的保种措施。研究运用现代分子生物学技术和PPAP以及计算机凝胶成像分析系统，从牛基因组DNA的提取、微卫星引物的PCR扩增、微卫星扩增产物的电泳分型等方面入手，测定分析草原红牛群体各位点等位基因数、等位基因大小、基因频率、多态信息含量(PIC)、杂合度，以期从分子水平探讨草原红牛群体的遗传变异，为草原红牛进一步的选育提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1试验动物及采血方法试验选用吉林省农科院畜牧分院牛场饲养的纯种草原红牛42头，颈静脉采血，EDTA抗凝，-20保存备用。1.1.2主要试剂TaqDNA聚合酶、4dNTP、蛋白酶K、RNAase、Tris饱和酚、Tris、EDTA、DNAMarker.N,N!-亚甲双丙烯酰胺、TEMED、尿素、丙烯酰胺、硝酸银、亲水硅烷、疏水硅烷、引物等。1.1.3主要仪器PCR仪、高速冷冻离心机、核酸测序电泳仪、紫外透射反射分析仪、电子天平等。1.2方法1.2.1基因组DNA的提取参考0分子克隆实验指南#[1],略有改进。1.2.2引物的筛选与合成选出5条染色体上的8个微卫星位点，从Internet网进入牛的微卫星数据库，查出相应的微卫星引物序列，引物由北京鼎国生物技术发展中心和赛百胜生物技术公司合成。8个微卫星位点的引物序列及PCR扩增反应条件见表1。1.2.3PCR扩增程序94预变性5min-94变性30s-退火45s-72延伸45s,35个循环，反应结束后72延伸10min。1.2.4PCR产物的检测及电泳分型扩增产物先在1・5%琼脂糖凝胶上电泳，并以核酸相对分子质量标准作对照，在紫外透射分析仪上观察是否有所需的条带，若有则继续转到8%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分型。采用银染法经过固定、漂洗、染色、显影、终止及清洗等步骤，得到凝胶图，拍照保存以判定基因型。微卫星(I)号码)重复染色体位置退火温度reMg2+/(inmoL浓度•l"单位产物引物序列DVGA-2()|0132GIAGACXAGGAAGOC：GCH；AGG2<j455510(D2S7)GAAAA(X：C\AGA(XX：U)\GA-46(CA)]]205AAATCCnTCAAGTATGTTTTCA19ql65()15(D19S18)ACTCACTCCAGTATTCITGTCTGTGL\-44nGgOCClAOCA*；2(]6515(D2SB)AG(IACrA\Ad^caBV11824(CA)I5187(；ITCAa；AC「G(；OC(：H；(：l、AAAC\Iq5915(D1S5I)ccrccivGCCACHTcrcTrarEHI225(CA)】*149GATC\anTGCCACTATITCCr9q6520(D9S1)ACXTGACAGCCAGCTGCTACFBM2113(CA)却150GCTGCClTCTACCAAATACa：2q5515(D2S26)CrTCCTGAGAGAXGG\AC\CCGGG\GAATGGATGGAACCAAATH)VGA-44(AC)|9211TICX；AAG\(I；GGC\GACAGG19q226()10U)VGA-55(ac)I2199GTGACTGFATITGTGAAG\OHA18q245510(D18SI6)IXTIAAMCGGAGGCAGAGATG1.2.5基因型的判定用凝胶成像系统携带的UVIBANDVersion99软件中的MW-RF功能分析计算全部个体各微卫星位点等位基因大小。以大小不同的扩增片段为不同的等位基因，按等位基因从小到大的顺序分别依次定名为A,B,C,D,E等。分析各微卫星座位全部个体的基因型。1.2.6统计分析利用遗传学群体与家系资料计算机分析系统PPAP3.0(PopulationandPedigreeAnalysisPrograms)软件分别计算本群体各位点基因频率、多态信息含量(PIC)和平均杂合度。平均多态信息含量(polymorphisminformationcontent,PIC)mm-ImPIC=1-xp.2-LZ2(Pfj)2il=1j二j+1其中m为等位基因数，Pi和Pj分别为第i和第j个等位基因频率。平均杂合度(heterozygosity,H)rnm1H=l-sP2i=1'=1其中m为等位基因数，Pi为第i个等位基因频率。2结果与分析2.1基因组DNA提取结果对采集的牛血样用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组20DNA。经0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，所提取的DNA在纯度、浓度、大小上均较好，见图1。图1DNA提取结果__2.28对微卫星引物扩增结果对8个微卫星位点的PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到PCR产物电泳检测结果，这里仅以BM2113电泳图为例来说明，见图2。图2BM2113聚丙烯酰胺凝胶电泳图...