茶叶多酚氧化酶的基因克隆山东农业科学2009,8:9～12ShandongAculturalSciences茶叶多酚氧化酶的基因克隆骆开明(广东省河源职业技术学院,广东河源517000)摘要:本试验以嫁接可可茶为材料,提取了高质量的茶树基因组DNA,以纯化的DNA为模板,利用Fs和RX引物组合进行PCR扩增,结果扩增出了约1800bp的片段,与预期大小一致.所克隆的PPO基因与其它茶树PPO基因的同源性达到98%,氨基酸序列同源性达到91%,确认为茶叶多酚氧化酶基因.关键词:嫁接可可茶;多酚氧化酶;基因克隆:Q785文献标识号:A:1001-4942(2009)08-0009-04GeneCloneofPolyphenolOxidasesinTeaLUOKai—-ming(HeyuanPolytechnicofGuangdongProvince,Heyuan517000,China)AbstractWiththepurifiedDNAextractedfromthegraftingcocoateaastemplate,1800bptargetfrag—mentwasamplifiedbyPCRusingFSandRXprimercombination.ThehomologybetweentheclonedDNAandthePPODNAofotherteatreesreachedto98%,whilethatinaminoacidsequencewas91%.Soitwascon—firmedtobetheteaPlPOgene.KeywordsGraftingcocoatea;PPO;Geneclone多酚氧化酶(Polyphenoloxidases,PPO)是自然界分布极广的一种氧化还原酶,也是茶树酶系统中一种重要的酶类.它不仅在生物氧化上起着催化作用,而且在食品加工中,如在制茶时利用酶促褐变促使茶叶品质形成中发挥着重要作用.2].PPO广泛存在于植物和食用菌等生物中,是引起蔬菜,水果,茶叶,烟草等农产品酶促褐变的主要酶类,它不仅影响果蔬及其制品的色泽和风味等感观质量,同时也会造成某些营养物质的破坏,贮藏性能和商业价值的降低,因而PPO的酶促褐变一直是食品领域的研究重点.在食品加工中,只有少数如红茶,可可,咖啡,梅干,葡萄干,枣干,发酵果汁等可以利用酶促褐变来提高其品质,大部分食品中的酶促褐变是需要采取相应措施来控制的-4J.可可茶(CamelliaptilopyhllaChang)是张宏达于1988年在广东龙门县南昆山发现的一类可供饮用的低咖啡碱含量的新茶树资源,其主要特征是内含物中可可碱含量比其它茶种高出许多,可高达6.8%.可可碱在生理和药理方面具有特殊的效果,其急性降压作用缓和,没有兴奋神经作用,有助于睡眠,具有强心作用,可提高机体动态耐力,能抗脂质过氧化,延缓机体衰老,同时能降低胆固醇和血脂,因此可可茶在保健功能上优于含有较多咖啡碱的传统茶叶,市场前景广阔J.本试验以嫁接可可茶为试材,克隆了PPO基因,它对酶制剂的开发利用和提高茶叶加工品质有着重要作用.1材料与方法1.1试验材料供试茶树品种:嫁接可可茶.供试菌株:大肠杆菌DH10B.1.2主要仪器设备低温冷冻离心机;PCR扩增仪;普通电泳系统;紫外分析仪;凝胶成像系统;电击转化仪;电子恒温水浴锅HH—6;超净工作台;CHB一1oo型恒温金属浴;Eppendorf5417R离心机.收稿日期:2009—04—29;修回日期:2009—06?30作者简介:骆开明(1968一),男,广东河源入,讲师,从事遗传工程与环境保护研究.E—mail:luokaiming0825@16310山东农业科学2009生1.3试验方法1.3.1茶叶DNA提取称取茶叶片约1.2g,加入PVP,研磨成细粉状,加人5ml抽提缓冲液(用时加2%13一巯基乙醇),65%水浴裂解10min,8000r/rain离心8rain,取上清;加入6ml酚一氯仿一异戊醇混合液(25:24:1),8000r/rain离心8rain,取上清;加人6ml氯仿,8000r/rain离心8min,取上清;加人10mol/LLiC1,8000r/rain离心8rain,沉淀为RNA,上清为DNA;吸取上清液DNA至1.5ml离心管中,加人15ml异丙醇,12000r/min离心5rain,取上清,加入70%乙醇0.5ml,12000r/rain离心2rain,所得沉淀即为初提DNA,加人5OlTE溶解.1.3.2DNA的纯化,鉴定及PCR扩增初提的DNA样品加入1/10体积的3mol/LNaAe,再加入2倍体积的无水乙醇;4℃冷冻离心机中12000r/rain离心15min,弃上清,加入75%乙醇300l清洗,12000r/rain离心5rain,所得沉淀即为纯化DNA,加入500lTE溶解,进行电泳检测和PCR扩增.1.3.3PCR产物纯化与回收在紫外灯下用刀片切含目的DNA条带的凝胶,按1mg凝胶加人1的比例加入NJ缓冲液(载样缓冲液:2%溴酚兰溶液和50%蔗糖溶液混合而成,用10mol/L的NaOH调成蓝色),把混合物置于65℃水浴7rain,使凝胶彻底融化;将溶解液加到DNA回收纯化柱上,把柱子装在干净的2rnl收集管内,于2000r/rain离心1min,流出液吸回纯化柱...