淡色库蚊视蛋口主要抗原域的原核表达及多克隆抗体制备*【摘要】目的为进一步研究蚊视蛋白参与杀虫剂抗性的相关分子机制及其作为现场抗性检测靶标提供多克隆抗体。方法以实验室前期制备的重组质粒pGEM®-TEasy/opsin为模板，通过基因工程手段克隆视蛋口胞外区片段，构建原核载体，IPTG诱导表达蛋白，并利用His亲和层析以及肠激酶酶切片段获得纯度较高的蛋白，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果成功构建淡色库蚊视蛋白主要抗原域的原核表达载体，经TPTGlmmol/L诱导3h后高效口J溶性表达重组蛋白，经His亲和层析及肠激酶酶切后获得纯度较高的蛋白，制备的多克隆抗体经WesternBlot证实能特异性地识别蚊视蛋白而不与非特异性蛋白结合。结论制备的多克隆抗体特异性好，效价较高，为进一步研究视蛋口参与杀虫剂抗性的分子机制及其作为现场抗性检测靶标捉供了基础。【中图分类号】R384・1【文献标识码】A【文章编号】ProkaryoticExpressionofMajorAntigenicDomaininOpsinEncodedbyCuiexpipenspallensandPreparationofPolyclonalAntibodyZOUPing,SUNYan,SUNHaibo,ZHUChangliang(DepartmentofPathogenicBiology,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China)【Abstract】ObjectToinvestigatehowproteinopsinparticipatesintheinsecticideresistanceandwhetheritcanbeusedasatargettestingresistance,aspecificrabbitpolyclonalantibodyofopsinwasobtainedfromaprokaryoticexpressionconstructofCulexpipenspallensopsin.MethodsThemainantigenicdomainencodingsequencedistributedinopsingenesofCulexpipenspallenswasamplifiedbyPCRmethodandinsertedintoaninducibleprokaryoticexpressiveplasmidpET-32a(+).Opsin-HisfusionproteinwasinducedbyIPTG,purifiedandrenaturedbyNi+affinitycolumnandenterokinase.ThepurifiedopsinproteinwasusedtoimmunizeNewZealandrabbitsforpreparingpolyclonalantibody.ResultsTherecombinantvectorsofCulexpipenspallensweresuccessfullyconstructed^Thefusionproteinwasabundantlyexpressedat3hoursaftertherecombinantvectorswereinducedbylmmol/LIPTG.WesternblotanalysisdemonstratedthatopsinexpressionproteincanbespecificallydetectedbytheantibodyinCulexpipenspallens.ConclusionThepolyclonalantibodyhashightiterandspecificity,anditwillbevaluableforthefurtherstudyonhowproteinopsinparticipatesintheinsecticideresistance・---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---【关键词】淡色库蚊；抗药性；视蛋白；原核表达；多克隆抗体[Keywords]Culexpipenspallens；insecticideresistance；opsin；prokaryoticexpressive；polyclonalantibody蚊是世界性分布的卫生害虫，它不仅吸血骚扰，而月•传播疟疾、丝虫病、登革热等多种疾病，严重危害人类健康⑴。随着全世界范围内杀虫剂的大量连续使用，蚊对杀虫剂逐渐产生了抗药性。世界一卫生组织预言“抗药性是控制虫媒病的最大障碍”。抗药性是由基因决定的、可遗传的、复杂的生物进化现象⑵。鉴定新的抗药性基因并研究其参与抗药性的机制成为媒介抗药性领域的研究重点。本实验室前期采用抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片法高通量筛选，并经定量PCR及转染试验重复验证，发现淡色库蚊视蛋口基因丹帀)与浪氧菊酯抗药性相关⑶，亦有报道视蛋白基因在果蝇DDT抗性品系内、致倦库蚊澳氧菊酯抗性品系内高表达皿】。但视蛋白参与杀虫剂抗性的机制，口前尚未见报道。本研究拟对视蛋口主要抗原域编码区进行克隆和原核表达并制备多克隆抗体，为进一步研究视蛋白参与杀虫剂抗性的分子机制及其作为现场抗性检测靶标捉供基础。1材料与方法1.1材料1」」菌种、克隆表达载体、培养基和生长条件大肠杆菌E.coliBL21(DE3)菌株、pET32a(+)原核表达载体菌种及重组质粒pGEM®-TEasy/opsin菌种均由本实验室提供。BL21(DE3)常规培养用LB培养基，37°C振荡培养，氨节霉素的工作浓度为50ug/mlo1.1.2酶及主要材料试剂ExTaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000Marker购口TaKaRa公司；限制性...