食品安全国家标准食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验1范围本标准规定了食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1冰箱：0℃～4℃。2.2恒温培养箱：26℃±1℃、36℃±1℃。2.3显微镜：10倍～100倍。2.4均质器。2.5天平：感量0.1g。2.6灭菌试管：16mm×160mm、15mm×100mm。2.7灭菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。2.8锥形瓶：200mL、500mL。2.9灭菌平皿：直径90mm。2.10微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。3培养基和试剂3.1改良磷酸盐缓冲液：见附录A中的A.1。3.2CIN-1培养基(CepulodinIrgasanNovobiocinAgar)：见附录A中的A.2。3.3改良Y培养基(AgarY，Modified):见附录A中的A.3。3.4改良克氏双糖培养基：见附录A中的A.4。3.5糖发酵管：见附录A中的A.5。3.6鸟氨酸脱羧酶试验培养基:见附录A中的A.6。3.7半固体琼脂:见附录A中的A.7。3.8缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见附录A中的A.8。3.9碱处理液：见附录A中的A.9。3.10尿素培养基：见附录A中的A.10。4检验程序小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。图1小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序5操作步骤5.1增菌以无菌操作取25g（或25mL）样品放入含有225mL改检样25g(或25mL)+225mL改良磷酸盐缓冲液，肉及其制品，其他食品0.5ml样液+4.5ml碱处理液，混合15s乳及其制品生化鉴定挑取可疑菌落,改良克氏双糖试验2h~4h26℃±1℃尿素酶试验半固体动力实验镜检血清分型（可选做）26℃±1℃24h接种CIN-1，改良Y培养基26℃±1℃48h±2h报告26℃±1℃48h~72h良磷酸盐缓冲液增菌液的无菌均质杯或均质袋内，以8000r/min均质1min或拍击式均质器均质1min。液体样品或粉末状样品，应振荡混匀。均质后于26℃±1℃增菌48h～72h。5.2碱处理除乳与乳制品外，其他食品的增菌液0.5mL与碱处理液4.5mL充分混合15s。5.3分离将乳与乳制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种于CIN-1琼脂平板和改良Y琼脂平板，26±1℃培养48h±2h。典型菌落在CIN-1上为深红色中心，周围具有无色透明圈（红色牛眼状菌落）,菌落大小为1-2mm，在改良Y琼脂平板上为无色透明、不粘稠的菌落。5.4改良克氏双糖试验分别挑取5.4中的可疑菌落3个～5个，接种于改良克氏双糖铁琼脂，接种时先在斜面划线，再于底层穿刺，26±1℃培养24h，将斜面和底部皆变黄且不产气的培养物做进一步的生化鉴定。5.5尿素酶试验和动力观察用接种环挑取一满环5.6得到的可疑培养物接种到尿素培养基中，接种量应足够大，振摇几秒钟，26±1℃培养2h～4h。将尿素酶试验阳性菌落分别接种于两管半固体培养基中，于26℃±1℃和36℃±1℃培养24h。将在26℃有动力而36℃无动力的可疑菌落划线接种营养琼脂平板，进行革兰氏染色镜检和生化试验。5.6革兰氏染色镜检小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌，有时呈椭圆或杆状，大小为（0.8μm～3.0μm）×0.8μm5.7生化鉴定5.7.1从5.5中的营养琼脂平板上挑取单个菌落，生化反应在26℃±1℃进行。小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要生化特征以及与其他相似菌的区别见表1。5.7.2如选择微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统，可根据5.5和5.6的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取菌苔，使用微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统进行鉴定。5.8血清型鉴定（选做项目）除进行生化鉴定外，可选择做血清型鉴定。在洁净的载玻片上加一滴“O”因子血清，将待试培养物混入其内，使成为均一性混浊悬液，将玻片轻轻摇动0.5～1min，在黑色背景下观察反应。如在2min内出现比较明显的小颗粒状凝集者，即为阳性反应，反之则为阴性，另用生理盐水作对照试验，以检查有无自凝现象；具体操作方法可按GB4789.4中沙门氏菌O因子血清分型方法进行。表1小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他相似菌的生化性状鉴别表项目小肠结肠炎耶尔森氏菌Yersiniaenterocolitica中间型耶尔森氏菌Yersiniaintermedia弗氏耶尔森氏菌Yersiniafrederiksenii克氏耶尔森氏菌Yersiniakirstensenii假结核耶尔森氏菌Yersiniapse...