人牙龈成纤维细胞原代培养及鉴定［摘要］目的：分离培养人牙龈成纤维细胞，为进一步研究细胞因子对牙龈成纤维细胞的调控作用提供实验条件。方法:用组织块法培养人牙龈成纤维细胞，并进行形态学和免疫学鉴定。结果:牙龈成纤维细胞原代培养成功并稳定传代，细胞呈长梭形或星形，免疫学鉴定抗波形丝蛋白抗体阳性，抗角蛋白抗体阴性，为中胚层来源的成纤维细胞。结论:组织块法培养的细胞符合牙龈成纤维细胞的形态学和免疫学特征，可作为体外细胞模型，为研究细胞因子对其功能的调控作用奠定基础。［关键词］牙龈成纤维细胞；细胞培养;鉴定［中图分类号］R329.2+8［文献标识码］A［文章编号］1673-7210(2010)01(c)-026-02TheprimarycultureandidentificationofhumangingivalfibroblastsCUIJuanl,SUNKeqinl,LIXial,ZHANGHuaping2(1.OralMedicineDepartmentofOralHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China；2.CentralLaboratoryofOralHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)[Abstract]Objective：Toisolateandculturehumangingivalfibroblasts(HGFs)invitro,andprovidetheexperimentalconditionforfurtherresearchontheHGFsregulationbycytokines・Methods：HGFswereprimaryculturedbytissueexplantculturetechniqueandidentifiedbymorphologicalanalysisandimmunocytochemicalanalysis・Results：TheHGFswereculturedandpassagedsuccessfully.Thecellsshowedlongspindleorstarappearance・Byimmunocytochemicalanalysis,thesecellstestedpositivetoanti-vimentinantibodyandnegativetoanti-keratinantibody,indicatingthecellsweremesodermderivedfibroblasts・Conclusion：ThecellsculturedbytissueexplantculturetechniqueareconsistentwithtypicalHGFs，characteristicsofmorphologyandimmunocytochemicalobservation.TheHGFsareusedascellmodelinvitroforfutureresearchonHGFsregulationbycytokines.［Keywords］Gingivalfibroblasts；Cellculture；Identification人牙龈成纤维细胞(humangingivalfibroblasts,HGFs)是牙龈结缔组织中的主体细胞，在牙周组织的保护和修复中起重要作用［1］。许多学者利用牙龈成纤维细胞体外培养模型，在牙周组织发病机制及治疗方面进行了有益的探索［2］。原代培养是获取牙龈成纤维细胞的主要手段，目前有酶消化法和组织块培养法［3］。本实验采用组织块法培养人牙龈成纤维细胞，为进一步研究细胞因子对牙龈成纤维细胞的调控作用提供实验条件。1材料与方法1.1主要试剂和仪器DMEM培养液（Gibco,美国）；胎牛血清（四季青,杭州）；胰蛋白酶（Sigma,美国）；抗波形丝蛋白抗体、抗角蛋白抗体、免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（中杉金桥，北京）；25ml塑料培养瓶、六孔板（Orangescientific,比利时）:RC03000-7C02培养箱（REVCO,美国）；GB-II超净工作台（北京市新技术应用研究所）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂）。1.2实验方法1.2.1组织来源牙龈组织取材于山西医科大学口腔医院口外科门诊因正畸需拔牙或者因手术需切除牙龈且牙龈无炎症的患者，征得其同意后切取牙龈组织，患者年龄12〜26岁。1.2.2组织块法培养及传代新鲜切取的牙龈组织立即投入预冷含双抗的DMEM培养液中（含青霉素100U/ml,链霉素100ug/ml）,在超净工作台中用5倍抗生素溶液浸泡消毒，在无菌培养皿中用眼科剪将牙龈组织剪成1mm3大小（剪切时在组织块上滴加DMEM培养液，且尽量去除上皮组织），用牙科探针将组织块以均匀间距分散接种于25ml培养瓶壁上,倒置培养瓶在C02培养箱中（5%C02.95%空气,100%湿度，37°C恒温）孵育4h后翻瓶,加入DMEM培养液。当细胞长至培养瓶底80%左右时，用0.25%胰酶消化，以1：2或1：3传代。1.2.3细胞的鉴定1.2.3.1形态学鉴定倒置显微镜下观察细胞由组织块边缘游出的情况，观察细胞形态及传代后细胞生长状况。1.2.3.2免疫学鉴定细胞传至4代，制成lX105/cm2的细胞悬液，制备细胞爬片，按免疫组化试剂盒说明书及DAB显色步骤，分别进行抗波形丝蛋白抗体、抗角蛋白抗体染色，以磷酸盐缓冲液（PBS）代替抗体作为阴性对照组，光镜下观察染色结...