GlcNAc糖基转移酶表达下调对tau蛋白磷酸化的影响【摘要】以人OGlcNAc糖基转移酶（OGT）基因为靶点，研究小干扰RNA（smallinterferenceRNA，siRNA）对HEK293T细胞中OGT基因表达的抑制作用，以及这种抑制作用对tau蛋白磷酸化与糖基化修饰的影响。方法：根据人OGT基因序列特点，设计高效且特异性强的siRNA。用脂质体转染siRNA进入HEK293T细胞，通过实时PCR检测siRNA对OGT基因表达的抑制。用蛋白免疫印迹法检测tau蛋白糖基化与磷酸化修饰的变化。结果：设计的siRNA能够有效抑制OGT基因的表达，与空白组相比，抑制效率可达78.1%左右。OGT基因表达的下调使tau蛋白糖基化水平下降，而磷酸化水平增高。结论：tau蛋白的糖基化负调节其磷酸化,葡萄糖摄入减少或代谢降低可能在阿尔茨海默尔病的发生发展中起关键作用。【关键词】阿尔茨海默尔病tau蛋白OGlcNAc糖基转移酶RNA干扰［Abstract］Objective:ToinvestigatetheinhibitoryeffectofsmallinterferenceRNA(siRNA)targetingOGTgeneonthealterationoftauphosphorylationandglycosylationlevelinhumanbeing.Methods：ThesiRNANCandthesiRNAtargetingOGTgenewerechemicallysynthesizedandtransfectedintoHEK293Tcellsvialipofectamine2000.RealtimePCRwasemployedtoevaluatetheefficacyofRNAinterference.TheleveloftauphosphorylationandglycosylationweredetectedbyWesternblot.Results：ThedesignedsiRNAcouldeffectivlydownregulatetheOGTmRNAexpressionto78.1%whilecomparedwithblankgroup.ThelevelofthetauphosphorylationatvarioussiteswassignificantlyupregulatedandthelevelofthetauglycosylationwasdownregulatedwiththeinhibitionofOGTgeneexpression.Conclusion：Themodificationofphosphorylationandglycosylationoftauproteinindicatedtheapparentnegativecorrelation,whichprobablywasinducedbydeficientbrainglucoseuptake/metabolisminAlzheimer′sdisease［Keywords］Alzheimer′sdisease;tau;O》RNAinterfering阿尔茨海默尔病（Alzheimer′sdisease,AD）的病理特征包括大脑局部尤其是海马和皮层神经元退行性病变，细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFT)和细胞外老年斑（senileplaque,SP）沉积。其中NFT的数量和患者的痴呆程度呈明显的正相关，被认为是AD患者神经原退化的病理基础［1,2］。NFT的主要成分是由异常过度磷酸化tau蛋白聚集而形成的双螺旋丝（pairedhelicalfilaments，PHFs）。过度磷酸化的tau蛋白除失去了其刺激和促进微管组装的功能外，还变成了毒性分子，可猎获正常的微管相关蛋白，使得微管崩解，神经细胞退化，最终导致AD患者的认知功能受到严重的损害。---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---蛋白质的修饰方式主要有磷酸化、糖基化、泛素化、经典糖基化、硝基化和OGlcNAc糖基化。其中蛋白质OGlcNAc糖基化是发生在细胞质与细胞核内的一种广泛动态的蛋白质翻译后修饰现象。这种糖基化是单个N乙酰氨基葡萄糖(Nacetylglucosamine,GlcNAc)通过O糖苷键连接到丝氨酸或苏氨酸(Ser/Thr)羟基上的。在AD患者脑中，tau蛋白OGlcNAc糖基化水平明显低于正常的老年人［3］。蛋白质的OGlcNAc糖基化程度是OGlcNAc糖基转移酶(OGT)和OGlcNAc糖苷酶（OGlcNAcase，OGA）共同作用的结果，OGT的作用是催化GlcNAc连接到肽链的丝氨酸或苏氨酸羟基上，UDPGlcNAc是它的供体底物，而OGA的作用是将GlcNAc从蛋白质的羟基上去除。用OGlcNAc糖苷酶抑制剂处理体外培养的大鼠脑片和神经细胞，以增加OGlcNAc糖基化的水平，则明显抑制tau蛋白多个位点的磷酸化，提示tau的OGlcNAc糖基化与磷酸化呈明显的负相关。本实验拟通过RNA干扰的方法来降低HEK293T细胞内OGT基因的表达水平，检测tau蛋白多个位点磷酸化与糖基化的变化，从而证明以上的推测，为进一步探讨AD的发病机制提供实验依据。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞、培养基与质粒HEK293T细胞株为本实验室保存。0.25%TrypsinEDTA，小牛血清，DMEM培养基，OptiMEM@Ⅰ均为Invitrogen公司产品。pCI/t...