食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定1范围本标准规定了液相色谱法测定游离核苷酸总量的方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中游离核苷酸总量的测定。（包括：胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸]2原理试样经过水提取，用沉淀剂沉淀蛋白质后，通过高效液相色谱分离，用紫外检测器外标法测定试样中核苷酸的含量。3试剂与材料注：除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水，液相色谱流动相用水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。3.1.2冰醋酸。3.1.3四丁基硫酸氢铵。3.1.4甲醇。3.1.5磷酸氢二钾（K2HPO4）。3.1.6磷酸二氢钾（KH2PO4）。3.1.7磷酸。3.2试剂配制3.2.1醋酸溶液（100mL/L）：吸取10mL冰醋酸，加水定容到100mL。3.2.2磷酸氢二钾溶液（0.1mol/L）：称取2.28g磷酸氢二钾，用超纯水溶解并定容到100mL。3.2.3磷酸盐缓冲液（1.40mmol/L四丁基硫酸氢铵，0.01mol/L磷酸二氢钾）：称取1.360g磷酸二氢钾，加0.4753g四丁基硫酸氢铵，加900mL水溶解，用磷酸氢二钾溶液调pH至3.2，用水定容到1000mL。（一周内使用。）3.3核苷酸标准品胞嘧啶核苷酸（简称CMP）（C9H14N3O8P）：纯度≥99%。腺嘌呤核苷酸（简称AMP）（C10H14N5O7P）：纯度≥99%。尿嘧啶核苷酸（简称UMP）（C9H13N2O9P）：纯度≥99%。鸟嘌呤核苷酸（简称GMP）（C10H14N5O8P）：纯度≥99%。次黄嘌呤核苷酸（简称IMP）（C10H13N4O8P）：纯度≥99%。3.4标准溶液配制核苷酸标准混合液（必须当天配置）：分别称取核苷酸标准品CMP、AMP、UMP、GMP和IMP各10mg（准确至0.1mg），于同一个100mL容量瓶中，用超纯水溶解定容至100mL。此标准溶液浓度为：CMP、AMP、UMP、GMP、IMP100μg/mL。（每个组分称取的质量都要校正水分和钠盐含量，以酸型计。）4仪器与设备注：常用实验室仪器及下列仪器设备。4.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。4.2天平：感量0.1mg。4.3pH计：精度0.01。5分析步骤5.1试样制备5.1.1样品预处理5.1.1.1含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约5g（精确至0.1mg），于100mL三角瓶中，加入约0.2g淀粉酶，加入20mL热水（30-℃40℃）充分溶解试样，或称取混合均匀的液体试样约20g（精确至1mg）于100mL三角形瓶中，加入约0.2g淀粉酶摇匀，于37℃±2℃培养箱内酶解30min。取出冷却至室温。5.1.1.2不含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约5g（精确至0.1mg），于100mL三角瓶中，加入20mL热水（50-60℃）充分溶解试样，冷却至室温，或称取混合均匀的液体试样约20g（精确至1mg）于100mL三角形瓶中。5.1.2待测液的制备用醋酸溶液调试样溶液pH4.1，移入50mL容量瓶中，定容，滤纸过滤，所得滤液用0.45µm微膜过滤备用。5.2参考色谱条件：流动相：磷酸盐缓冲液：甲醇＝1000：40色谱柱：C18极性色谱柱（250×4.6mm，5μm）或具同等性能的色谱柱。流速：1mL/min波长：254nm柱温：25℃进样体积：10µL5.3标准曲线绘制：分别吸取标准混合溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，加超纯水定容至50mL，配成核苷酸系列标准工作液。表1核苷酸系列标准工作液各组份浓度单位为μg/mL序号CMPAMPUMPGMPIMP144444288888312121212124161616161652020202020将上核苷酸系列标准工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高。以峰面积或峰高为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线。5.4试样溶液的测定将制备好的试样溶液注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高。根据标准曲线得到待测液中核苷酸的浓度（μg/mL），平行测定次数不少于两次。6分析结果的表述6.1结果计算试样中游离核苷酸各组份的含量X（CMP、UMP、GMP、IMP、AMP）分别按公式（1）计算：…………………………………（1）式中：X——试样中核苷酸各组份的含量（分别是：CMP、UMP、GMP、IMP、AMP），单位为毫克每百克（mg/100g）；Ci——试样溶液中核苷酸各组分的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；Vi——试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；mi——试样的质量，单位为克（g）；n——样液稀释倍数。试样中游离核苷酸的总量按公式（2）计算：...