CAT为报告基因的铜绿假单胞菌启动子文库的建立及初步鉴定摘要：以CAT(chloramphenicolacetyltransferase,CAT)为报告基因，构建pCAT2启动子探针我体从绿脓杆菌基因文库中筛选启动子oSau3A1酶切铜绿假单胞菌的基因组，回收(500-15OObp)片段并与pCAT2载体连接构建铜绿假单胞菌的基因组文库，PCR鉴定文库的多样性，利用氨霉素(10ug/mL)和卡那霉素(50ug/mL)双抗平板筛选了16株阳性菌株，并用PCR、测序、NCBI比对进行鉴定。构建的基因文库的库容臺可达50000个,覆盖基因全长的3.5倍，插入率达90%,具有较强的随机性。采用双抗平板进行启动子的筛选,筛选效率高达96%o获得了绿脓杆菌基因组中的9个启动了，同源性达99%以上，并对其活性进行初步鉴定，为铜绿假单胞菌基因表达调控的进一步研究奠定基础。关键词：氯霉素乙酰转移酶(CAT)；报告基因；铜绿假单胞菌(PA)；启动子文库中图分类号：R37文献标识码：A文章编号：1007-7847(2014)06-0521-06氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicolacetyl-tnmsfeTase,CAT)是一种原核酶类，含有CAT的细菌暴露在氯霉素中可以使其乙酰化而失去活性，这是某些细菌抗氯霉素的主要原因，该酶能在大肠杆菌中表达，且非常稳定，是常用的报告基因之一。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruguzosa,PA)义名绿脓杆菌,是一种广泛存在于自然界的革兰氏阴性条件致病菌，当机体免疫机能低下时可引起多种感染。近年来，对人的致病作用明显增加，是一系列严重的化脓性感染，尤其是支气管扩张、慢性支气管炎、囊性肺纤维化等疾病继发感染的重要致病菌，是病人在住院期问感染的第3大致病菌。细菌进入机体并生存下来需要一定的适应机制，其中涉及调控元件如启动子、增强子、终止子等。而在这些调控元件中，启动子是位于编码基因上游与RNA聚合酶识别、结合的一段特殊DNA序列，起着“开关”的作用。因此，本研究以CAT为报告基因构建了一个缺乏启动子的探针载体，构建绿脓杆菌基因组文库从中“钓取”启动了片段，并对启动了的活性进行初步鉴定，为进一步研究铜绿假单胞菌的基因调控奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株与载体感受态大肠杆菌DH5ci,铜绿假单胞菌（ATCC27853）,质粒pACYC184>pPhoA、pET-MR均为昆明理工的大学基因工程与制药实验室保存，pMD18-T购自宝生物工程（大连）有限公司。1.1.2工具酶和主要试剂限制性内切酶（SalLXhoI、S（LCI、BglII）、DLDNAmarker2000>DLDNAmarker5000>T4DNA连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。质粒DNA小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购白北京庄盟国际生物基因科技有限公司。RNaseA购白生工生物工程（上海）股份有限公司。蛋白酶K购自Fermentas（加拿大）公司。TaqDNA聚合酶I购白天根生化科技（北京）有限公司。LB培养基：酵母粉5g・胰蛋白10g,NaCl10g,定容至1L（固体加2%的琼脂）。卡那霉素、氯霉素、氨节青霉素、PCR试剂均购白生工生物工程（上海）股份有限公司。1.2方法1.2.1CAT基因扩增引物的设计：参考pACYC184载体中CAT序列设计引物，在引物上下游分别引入NdeLXhol酶切位点，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列见表1。目的片段的扩增：用引物1和引物2,以pA-CYC184质粒为模板，扩增CAT基因。PCR参数：94°C预变性5min；94°C变性30s；50°C复性30s、72°C延伸40s,循环35次；72°C总延伸5min。采用1・5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，小量琼脂糖凝胶试剂盒纯化冃的片段。T・A克隆至pMD18-T,获得pMD18-T-CAT,用NdeI和Xhol双酶切鉴定，并送华大基因测序。1.2.2PCAT2载体的构建测序正确后,NdeI>XhoI双酶切pMD18T-CAT,回收小片段。pER-MR载体（图1）用限制性内切酶NdeI和XhoI双切，胶回收载体大片段二将两者用T4DNA连接酶连接，转化E.coliDH5a,kan+抗性平板筛选。随机挑选平板上长出的单个菌落接种于LB液体培养基过夜培养后提质粒，双酶切鉴定。鉴定正确的载体命名为pCAT2。1.2.3铜绿假单胞菌基因组提取、酶切与回收从・80°C冰箱中取出保存的铜绿假单胞菌，室温融化后取50UL菌液加入到盛有5mLLB液体培养基中，37°C过夜培养至对数生长期的中晩期时收获细菌，提取细菌基因组DNA,具体过程如下：取5mL铜绿假单胞菌12000r/min离心lmin,沉...