甲状腺癌中医辨证唾液蛋白质组诊断模型研究摘要：目的探讨甲状腺癌不同证型患者的唾液蛋白表达质谱的差异并构建诊断模型，为甲状腺癌的中医辨证分型提供客观依据。方法应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术分别检测23例痰瘀互结型和26例肝郁气滞型甲状腺癌患者的唾液蛋白质指纹图谱，筛选出2组间特异性表达差异蛋白，并结合生物信息学方法建立诊断模型。结果通过2组唾液蛋白质指纹图谱数据比较，共获得29个有明显差异的蛋白峰(P<0.01),其中M/Z3809.85、3110.04、4970.80被选择用于构建最佳决策树模型，该模型的测试组总准确率为85.7%(42/49),灵敏度为84.6%(22/26),特异性为86.9%(20/23)o结论初步建立了甲状腺癌的唾液蛋白质指纹图谱辨证模式，为中医证候实质研究提供了新的方法和途径。关键词：甲状腺癌；唾液；中医证候；蛋白质组学；表面增强激光解析电离飞行时间质谱中图分类号：R273.61文献标识码：A文章编号：1005-5304(2013)04-0013-03甲状腺癌为常见的恶性肿瘤之一，发病率占头颈部恶性肿瘤发病率的首位[1],且有年轻化趋势。甲状腺癌属于中医“瘻瘤”范畴，中医辨证论治甲状腺癌积累了丰富的经验，且取得了很好的的疗效。但中医证候缺乏物质基础和客观的实验室特异性指标，临床上带有很大的主观性。蛋白质组学(proteomics)是指应用各种技术手段來研究蛋白质组的一门新兴学科，研究技术主要包括蛋白质的分离、鉴定，蛋白质芯片及生物信息学等一些先进的技术。其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。蛋白质组的整体性、动态性、时空性、复杂性等特点和中医“证”有着惊人的相似，其中可能存在某种内在联系和对应关系［2］。表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术是蛋白组学研究中的一个新的高通量的技术平台，本研究应用SELDT-TOF-MS技术检测甲状腺癌不同证型患者唾液样品的蛋白质指纹图谱，探讨不同证候唾液蛋白表达差异的变化规律。1资料与方法1.1研究对象2008年10月-2009年9月，在深圳市第二人民医院初次住院治疗，经病理学证实为甲状腺癌，且符合中医肝郁气滞或痰瘀互结证型的49例患者，并排除其他系统相关疾病。本试验经本院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。在入院时(治疗前)釆集唾液样本。其中肝郁气滞组26例，女性24例，男性2例，年龄24〜55岁，中位年龄42岁；痰瘀互结组23例，女性19例，男性4例，年龄25〜57岁,中位年龄43岁。经统计学分析，2组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)o1.2中医辨证标准参照《中医病证诊断疗效标准》［3］中的证型标准。①肝郁气滞型：情志抑郁、胸闷不舒，心悸易汗，口干、便秘；颈部肿物，质坚硬，活动度范围小或不随吞咽上下移动，遇郁怒肿块增大；妇女可见乳房作胀疼痛,月经不调；舌质淡红，苔薄白或微黄，脉眩。②痰瘀互结型：病程较长，胸闷痰多、肢体倦怠、胃纳不佳、颈部肿块质硬，表面不平，随吞咽上下移动受限或推之不动，或伴有淋巴结的转移，多伴有疼痛；舌质多紫黯或有斑点，舌苔多厚腻，脉象可见弦滑或沉涩。1.3主要试剂与仪器PBSII-C型蛋白质芯片阅读仪、NP20芯片均为美国Ciphergen公司产品。纯水(HPLC级)、SPA(Sinapinicacid)、乙鼠、三氟乙酸均购自美国Sigma公司。1.4研究方法1.4.1唾液样本的收集与处理晨起空腹时采集唾液样本，收集到15mL离心管中，4°C下静置1h后，10000r/min>4°C下离心10min。冰浴上分装在1mLEP管中，每管50?L,于-80°C冰箱保存。实验时取出样木，冰上解冻，所有检测唾液样木均1次冻融，4°C下离心5min备用。1.4.2芯片的处理和样品检测取唾液上清，每条芯片的每个点直接上样4?L,自然晾干后重复上样1次，待干后将芯片装入96孔蛋白质芯片工作支架Bio-Processor中，每孔加入10?L纯水，置振荡器上600r/min^4°C下振荡10min,甩掉，拍干，重复1次。将芯片从Bio-Processor中取出，自然晾干后每点加半饱和SPA溶液0.5?L,重复1次，待干后即可上机检测。1.4.3数据采集设置激光强度为220,灵敏度为9,收集数据的质荷比范围为2000-20000M/Z,优化范围为2000-1...