农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立江苏农业科学2011年第39卷第3期一67一赵莉,钟鸣,马慧,等.农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立[J].江苏农业科学,2011,39(3):67—68,74农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系的建立赵莉,钟鸣,马慧,李浩戈,陈丽静,钟声(沈阳农业大学/辽宁省农业生物技术重点实验室,辽宁沈阳110161)染时间,共培养时间,不同浓度头孢霉素,卡那霉素对农杆菌的抑菌效果及其对烟草叶片分化的影响等进行探索,建立了一种稳定高效的烟草遗传转化体系.关键词:烟草;根癌农杆菌;浸染;遗传转化中图分类号:$572.032文献标志码:A文章编号:1002—1302(2011)03—0067—02由于烟草的组织培养简单,基因转化效率较高等优点,烟草成为植物基因工程和分子生物学研究中重要的模式植物..自从Horsh等首次获得烟草转基因植株以来,以烟草为材料的转基因技术为基因功能分析提供了有效途径,因工程中,目前研究最清楚,应用最广泛的外源基因转化方法是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的遗传转化技术,在已获得的近200种转基因植物中约有80%是由农杆菌介导完成的.因方法简单,效率高,拷贝数少等优点,它已成为目前主要的转基因技术.建立快速,高效,简便的植株遗传转化体系对快速获得转基因植株至关重要.其中,外植体的选择及其特定的生理状态,抗生素的筛选,农杆菌浸染浓度,浸染时间,外植体的暗培养时间等是植株遗传转化体植体,通过农杆菌介导的叶圆盘法对烟草进行遗传转化,探索农杆菌介导的遗传转化条件及其影响因素,建立农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系,为目的基因功能的研究提供较好的基础.1材料与方法1.1.1植物材料以烟草品种中烟100为试验材料,种子浸于体积分数75%乙醇中30s,用无菌水冲洗,然后浸于0.1%氯化汞中4rain,滤出种子,再以无菌水清洗3—5次,用滤纸吸干.将消过毒的种子接种于播种培养基(1/2MS)中,于26℃光照条件下培养,得到烟草无菌苗叶片.1.1.2菌株和质粒转化受体菌为根癌农杆菌EHA105,载体为pBI121,含卡那霉素筛选抗性基因以及目的基因,利用液氮直接转化法将质粒转入农杆菌中.收稿日期:201l一01一l4基金项目:国家自然科学基金(编号:20977095,31070448);辽宁省农业生物技术重点实验室专项基金.作者简介:赵莉(1985一),女,河南鹤壁人,硕士研究生,主要从事—mail:zhaozhao336@163.通信作者:钟鸣,博士,副教授,主要从事植物生物技术的研究.E—mail:mingzhl@sina.tom.体用无菌水冲洗4～5次,用滤纸吸干表面水分,再分别转到附加不同质量浓度(100,200,300,400,500,600mg/L)的头孢筛选分化培养基上进行培养.每处理30个外植体,3组重复.统计外植体污染率和抗性芽分化率,从而确定最合适的抗生素浓度.1.2.2外植体的选择选取30,50,80,120d的烟草叶片,避开边缘及主脉用打孑L器打成圆盘状,再分别浸入农杆菌菌液中进行浸染,同时设置未浸染叶片为对照.草叶盘分别接种到含卡那霉素0,20,40,60,8O,100mg/L的MS培养基上,每处理接种3O个外植体,3组重复,培养3—4周后统计外植体出芽率,从而确定卡那霉素的筛选浓度.1.2.4农杆菌菌液浸染时间的确定将烟草叶盘分4组,每组30个外植体,设3组重复.置于活化的农杆菌(D为0.6)悬浮液中浸泡,间歇摇动,使叶片与菌液充分接触,4组浸染时间分别为3,6,9,12min.浸染完毕后取出叶盘,用无菌滤纸吸干表面菌液,转入MS分化培养基中,暗培养2d,再转入MS培养基中进行筛选培养.草叶盘转入MS分化培养基中,分别暗培养1,2,3,4d,然后转入MS培养基中进行筛选培养.每处理30个外植体,3组重复.统计外植体抗性芽分化率,从而确定共培养时间.—PCR鉴定因植株的DNA为模板,以含有目的基因片段的质粒为阳性对照,以野生型植株作阴性对照,进行PCR扩增鉴定.(2)RT—的转基因苗和野生型烟草幼嫩叶片的总RNA,并反转录成eDNA,以目的基因的特异引物RT—PCR分析目的基因转录水平的表达情况.2结果与分析由图1统计得出,抗生素浓度对外植体分化具有明显的影响.当培养基中加入头孢霉素的浓度为400mg/L时,抗性一68一江苏农业科学2011年第39卷第3期芽的分化率最高,达到31.1%;当抗生素浓度过低而无法抑制农杆菌的生长时,外植体污染导致死亡;当抗生素浓度过高时,虽能有效抑制农杆菌的生长,但是外植体严重白化,抗性芽...