:1007-8738(200302-197-03新生大鼠海马神经元原代培养方法的研究王英,车宇,苗建亭,李柱一,王者晋(第四军医大学唐都医院全军神经内科中心,陕西西安710038收稿日期:2002-07-03;修回日期:2002-10-18基金项目:“”军队十五医药卫生科研基金资助项目(No.01Q112第四军医大学创新工程基金资助项目(No.CX01A018作者简介:王英(19692,女,黑龙江齐齐哈尔人,主治医师,硕士生.导师:王者晋.Tel.(0293377130ThestudyofprimaryculturemethodsforhippocampalneuronsofnewbornratsWANGYing,CHEYu,MIAO激an2ting,LIZhu2yi,WANGZhe2jinPLACenterofNeurology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,ChinaAbstractAIM:Tocomparethreedifferentmethodsforneuronculture,soastoprovideaculturetechniquewithhigherneuronpurityandsur2vivalrate.METHODS:Neuronsinhippocampalregionofnew2bornSDratswereculturedbycommonculturemethod,cytosinearabinoside(Ara2c2supplementingmethod,Ara2candnervegrowthfactor(NGF2supplementingmethod.Thenmorphologyofneuronswasobservedundermicroscope.Thesurvivalratesoftheneuronsatdifferentculturewerecomparedbyin2vertedmicroscopeobservationandMTTcolorimetry.Thepurityofneuronsculturedby3methodswasdetectedbyimmunocyto2chemicalstaining.RESULTS:NeuronsculturedbyAra2candNGF2supplementingmethodgrewwell.ThepurityandsurvivalrateofneuronsculturedbyAra2candNGF2supplementingmethodwashighest.CONCLUSION:Ara2candNGF2supple2mentingmethodisagoodmethodforneuronculture.Keywords:neuron;cellculture;survivalrate摘要目的:研究和比较3种不同培养神经元的方法,提供一种纯化效率和存活率均较高的培养技术。方法:取新生SD大鼠的海马区,应用一般培养法、加阿糖胞苷法、加阿糖胞苷和神经生长因子法培养神经元,观察神经元的形态。用倒置显微镜观察和MTT比色分析检测神经元的存活率。用ABC免疫组化染色法,比较3种不同培养方法在不同培养时间所获得神经元的纯度。结果:加阿糖胞苷和神经生长因子培养组神经元生长良好,纯度和存活率均较高。结论:加阿糖胞苷和神经生长因子培养神经元的方法具有简便可行,易于生长的优点,可作为神经元体外培养的良好模型。关键词:神经元;细胞培养;存活率:R392233文献标识码:B国内从1960年代培养脑神经细胞以来[1],神经细胞的培养方法逐渐增多,并在不断改进。本实验室为了进行Alzheimer病(AD的病因及病理学研究,建立了新生大鼠海马细胞分散培养模型,并且对不同培养方法进行了对比分析,获得了一种简便可行、易于生长的培养方法,既提高了神经元的纯度,又提高了神经元的存活率。1材料和方法1.1材料当天出生的SD大鼠,由本校实验动物中心提供。DMEM培养基为Gibco公司产品。100mL/L胎牛血清(FCS及100mL/L马血清(HOS,均为Hyclon公司产品。神经生长因子(NGF由军事医学科学院提供。聚L2赖氨酸为Sigma公司产品。1.2方法1.2.1培养皿的处理用35mm孔径的6孔培养板或塑料培养皿,其中放置盖玻片。每个培养皿中加入0.1g/L的聚L-赖氨酸2mL,静止30min除去溶液,以D2Hanks液浸洗后,加入适量培养液,放培养箱内4h后弃液待用。1.2.2海马神经元的培养取新生SD大鼠,断头处死后放入750mL/L酒精中消毒1min,置于装有无菌冰的培养皿中。取出脑,剔除脑膜和血管,分离出双侧海马,用冰浴的解剖液清洗2次,剪碎,加1.25g/L胰酶2mL。放入37℃、5%CO2培养箱中消化15min后,用2mL含有100mL/LFCS的DMEM终止胰酶反应,离心。吸去上清,加种植培养液(含200mL/LFCS的DMEmL,轻轻吹打,用筛网过滤。以1×109/L细胞数种植,每皿2mL。24h后全量换液,以后每wk换液2次,每次换半液。1.2.3海马神经元的形态观察为观察神经细胞的生长、分化,以及非神经细胞和NGF对神经细胞生长、发育的影响,本实验分为实验组和对照1组、对照2组。实验组于培养的第3天,在培养液中加入阿糖胞苷(Ara2c10μmol/L,作用24h后更换新培养液,(含NGF25μg/L。对照1组于培养液中仅加Ara2c,对照2组的培养液中不含Ara2c和NGF。1.2.4神经元纯度的测定分别取培养1、3、7、12、14和28d的海马区神经...