斯钙素J在肝癌中的表达及其临床意义杨明1,2韩涛2谢晓冬2(通讯作者)(1阜新市细河区四合镇人民医院123000；2沈阳军区总医院110000)【摘要】目的探讨STC・1与肝癌患者临床病理特征的关系及其对预后判断的指导意义。方法应用RealtimePCR和ELISA等方法从基因水平和蛋白水平对肝癌患者及健康人群进行STC-1表达分析。结果进一步分析发现STC-1表达与AFP等肝癌血清学指标有一定的相关性，且与肝癌的大小、Admenson分期等密切。结论首次发现STCJ在肝癌中高表达，是肝癌潜在的早期诊断预警指标物。【关键词】STC-1肝癌分子标志物【中图分类号】R730.5【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2014)09-0132-02肝细胞肝癌(HCC)居恶性肿瘤发病率第四位，在我国高居恶性肿瘤死亡率的第二位⑴。据WHO统计数据显示近10来年全世界每10位新发肝癌中就有4人发生在中国［2］。目前尚缺乏一种十分特异的外周血肝癌分子标志物，研究发现人类糖蛋白激素■斯钙素(STC-1),有可能成为一种新的外周血肝癌分子标志物。对于STC1的研究，国内文献很少报道。木研究应用RealtimePCR和ELISA法在肝癌患者及健康人群外周血中检测STC-1在基因水平和蛋白水平的表达情况，并进一步分析STC-1mRNA表达水平与肝癌患者临床病理参数及肝癌患者预后的关系。一、材料与方法(壱)临床资料2010年7月〜2013年1月在沈阳军区总医院进行治疗的62例肝癌患者，治疗前均经病理明确诊断为肝细胞性肝癌，年龄为(28〜70)岁，平均(51.72±9.06)岁;10名健康人群作为对照组,年龄为(24〜83)岁,平均(48.70±14.32)岁，患者与对照组年龄的比较t=1.28,P=0.33,差异无统计学意义。---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---肝癌患者均为手术之后来我科进行治疗的患者。（二）血清RNA提取及定量先将室温调至21°C,淋巴细胞分离液分装保存，使用时使其温度升至室温摇匀后再用，离心机温度为室温，4°C离心机提前预冷，备好3个15ml无菌离心管，2个EP管；采集肝癌患者和健康女性外周血3ml,混匀，4°C不超过4h；在离心管中加入等体积生理盐水对血液进行等倍稀释，混匀，在另一离心管中加入3ml淋巴细胞分离液（以下简称分离液），将处理好的血液用滴管沿管壁缓慢加至分离液面上（关键步骤），1500rpm,离心15min,取出离心管，可见离心管中液体分为四层，第二层液体呈乳片色絮状物，为实验所需部分；收集第二层置入含5ml生理盐水的离心管中，混匀，1500rpm,离心15min,洗涤细胞两次，弃上清，即得所需单个核细胞；进行RNA提取及定量。（三）RealtimePCR检测在无RNase的PCR管中加入所需反应体系（TotalRNA2?g,OligoDtl?L,逆转录酶1?L,2XPCRmix1O?L,DEPC水补至总体积20?L）,混匀，42°C孵育30min,85°C孵育5min即得20?l的cDNA溶液,保存于・20°C。引物在pubmed网站自行设计，经BLAST验证，由上海Invitrogen公司合成，STC-1±游引物5’-CACACCCACGAGCTGACTTC-3’,下游引物5’-TCTCCCTGGTTATGCACTCTCA-3’；β-actin上游引物，F:5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’下游引物R:5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’,取上述cDNAl?l,上游引物l?l,下游引物1?1与2XSYRBGreen混合，用DEPC水补齐至25?1,轻轻混合，94°C预变性3min,94°C变性30sec,退火30sec,72°C延伸40sec,30至35个循环，72°C终末延伸lOminoPCR产物realtimePCR仪分析。（四）酶联免疫吸附试验（ELISA）采集肝癌患者和健康女性外周血3ml,2500rpm,离心lOmin,取上清分装至3个无菌EP管，标记后冻于・20°C备用。进行ELISA实验前先将室温调整到23°C,待测样品和所需试剂放置室温下平衡至少30min,并充分混匀；确定此次实验所需微孔数目，将其放置到配套板架上并标记；按要求用蒸憎水稀释浓缩清洗液,充分混匀备用；将---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---标准品（按浓度梯度）及待测品滴入微孔中，（STC-1：每微孔50μl）；向加有待测品的微孔中滴入生物素标记物，每微孔10μl,在加有标准品及待测品的微孔中滴入酶标记物，每微孔50μl,混匀；微孔板覆膜放至37°C恒温箱孵育，lh后取...