一株鸽源C型产气荚膜梭菌的分离与鉴定摘要：从武汉某地拾到一只死亡的信鸽，剖检观察其病变疑似鸽坏死性肠炎，从其肠内容物中分离到1株细菌，対分离菌株进行形态观察、生化试验、细菌外膜蛋白基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增的基因型鉴定及动物试验等，结果鉴定该分离菌株为c型产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)o关键词：鸽产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)；分离；鉴定中图分类号：S852.61+6.3文献标识码：A文章编号：0439-8114(2013)23-5808-03产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)又称魏氏梭菌(Clostridiumwelchii),广泛存在于自然界的土壤、水源、人及动物肠道中，是导致人和多种动物疾病的人兽共患病原菌，严重威胁动物及人类公共卫生安全。Welchii和Nutall于1892年首先从一具腐败的人类厂体中分离得到该菌，并命名为魏氏梭菌，之后世界各地均有各种动物感染该菌发病的报道[1-3]o产气荚膜梭菌通过产生多种外毒素致病，其中Q、13、Y、§是主要的致死毒索，按其所产生的毒索分为5种基因型，其中A型菌产生a毒素，C型菌产生ci、0毒素。禽类感染A型或C型产气荚膜梭菌可导致坏死性肠炎，造成严重损失[1-3],因此对该菌的分离鉴定和基因分型，对禽类坏死性肠炎的防治研究具有重要意义。2013年3月从武汉某地拾到一只死亡的信鸽，剖检观察其小肠肠管扩张充气、出血严重，粪便呈暗绿色，疑似鸽坏死性肠炎病变，遂取其小肠后段内容物接种于CW琼脂培养基，从中分离到1株细菌，经鉴定为C型产气荚膜梭菌。1材料与方法1.1材料病料来源：2013年3月于武汉某地拾到的一只死亡的成年信鸽。培养基：CW琼脂基础（含卡那霉素）、50%卵黄盐水悬液购自青岛日水牛物技术有限公司；含卡那霉素+卵黄的CW琼脂培养基按使用说明书自制。厌气肉肝汤、肉肝胃酶消化汤按《中华人民共和国兽用生物制品规程》[4]自制。参考菌株：A型产气荚膜梭菌（C57-12株）、C型产气荚膜梭菌（C59-37株）冻干菌株购口中国兽医药品监察所；大肠杆菌由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医研究室分离保存。1.2方法1.2.1病原菌的分离与鉴定1）细菌的分离培养。无菌取死鸽小肠后段内容物划线接种于CW琼脂培养基，42€厌氧培养48ho挑取单个疑似菌落纯化培养，取纯培养物接种于厌气肉肝汤，42°C厌氧培养24h,做进一步鉴定。2）紫牛乳鉴定。取分离菌的厌气肉肝汤培养物接种于紫牛乳微量生化反应管中，42°C厌氧培养16h,观察是否出现爆裂发酵现象。3）细菌形态观察。挑取分离菌纯培养物涂片、革兰氏染色、镜检。4）细菌生化试验。取分离菌的厌气肉肝汤培养物分别接种于葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、明胶、II2S、硝酸盐、卿味微量生化反应管，42°C厌氧培养24h。硝酸盐生化反应管加入硝酸盐还原试剂甲、乙各1滴，卩引味生化反应管加入靛基质试剂1滴，明胶反应管培养48h,放入4°C冰箱30min,观察结果。1.2.2细菌的基因型鉴定采用PCR扩增分离菌株的a-毒素基因、B-毒索基因方法鉴定其基因型,具体参照文献［5,6］的方法进行。用煮沸法提取分离菌株及参考菌株的模板DNAo反应体系：10XPCRBuffer5.0PL,dNTPs1.0uL(10mmoL/L),上、下游引物各l・0UL(10Umol/L),TaqDNA聚合酶2.5U,模板10ML,用双蒸水补足至50uLo反应程序：94°C预变性5min；94°C变性1min,55°C退火1min,72°C延伸1min,30个循环；72°C延伸10min后于4°C保温，结朿反应。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，对扩增的基因片段进行测序分析，PCR产物测序由上海生工生物技术有限公司完成。1.2.3动物试验将纯化分离菌株接种于肉肝胃酶消化汤，42°C厌氧培养6h,将菌液腹腔注射3只小鼠，0.3mL/只，对照组3只小鼠注射等量生理盐水，观察24h0解剖死鼠，肠内容物涂片、染色、镜检。2结果与分析2.1病原菌的分离与鉴定结果2.1.1菌落形态疑似菌落在含卡那霉索+卵黄的CW琼脂培养基上呈圆形、微隆起、卵黄色、表面褶皱、周围形成白浊环、中等人小的菌落。2.1.2紫牛乳鉴定结果分离菌的紫牛乳鉴定为阳性反应，出现爆裂发酵现象。2.1.3细菌形态在油镜下观察分离菌为革兰氏阳性，菌体两端钝圆,粗杆状，单个、成双或者成短链状存在。2.1.4细菌生化试验结果分离菌对葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖...