红三叶ISSRPCR反应体系的建立与优化摘要：采用正交试验设计，对影响红三叶ISSR-PCR反应较大的4个因素(TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP及引物)在4个水平上进行筛选，建立并优化了适合红三叶ISSR分析的最佳反应体系。在25UL反应体系中各反应物的最适含量为40ng模板DNA，10XPCR-buffer2.5uL,2.5mmol/LMg2+,2.5UTaqDNA聚合酶，引物1umol/L,0.2mmol/LdNTP。反应程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，引物退火30s,72°C延伸1min,循环35次；72°C延伸7min,4°C保存。优化体系的建立为采用ISSR分子标记技术进行红三叶种质资源遗传多样性分析提供了技术参考。关键词：红三叶；ISSR-PCR;正交优化中图分类号：S541；Q75文献标识码：A文章编号：1009-5500(2015)02-0021-06红三叶(Trifoliumpratense)为豆科三叶草属多年生草本植物，生存5〜8年。中国新疆、吉林、云贵高原、湖北鄂西山地都有野生分布，江淮流域、华南、西南和西北等地均有栽培，是长江流域以南及甘肃二阴区优良的豆科牧草［1，2］。红三叶生长速度快、再生力强、产草量高、草质柔嫩多汁、适口性好、营养价值高，各种畜禽和鱼类均喜食［3］。目前，三叶草遗传多样性研宄主要采用RAPD［4，5］、SRAP［6］、SSR［7］等技术，而且大多集中于白三叶。对红三叶种质资源的研究主要集中在栽培技术［8］，株型结构［9］，营养价值［10］，转基因［11］，异黄酮［12］等方面，利用ISSR标记研宄红三叶遗传多样性具有实际价值。ISSR标记是在微卫星分子标记基础上发展起来的一种分子标记［13］。该技术利用简单重复序列(SSR)来设计引物，无需预先克隆和测序，操作简单易行。ISSR引物序列长、退火温度高、特异性和稳定性增强，可检测到更丰富的遗传变异［14］。ISSR标记结合了RAPD和SSR的优点，具有模板需要量少，多态性丰富，无需试剂盒，结果记录方便，试验成本低，操作简单，试验稳定性高等优点而倍受青睐［15］，广泛应用于生物研宄的各个领域。近年来，ISSR分子标记技术已开始应用于草种质资源遗传多样性研宄，在早熟禾(Poaannua)［16］、鹅观草(Roegneriakamoji)［17］、燕麦(Avenasativa)［18］、披碱草(Elymusnutans)［19］、紫花苜蓿(Medicagosativa)［20］＞昆仑锦鸡儿(Caraganapolourensis)[21]、小花棘豆(Oxytropisglabra)[22]和扁蓄豆(Ruthenianmedic)[23]等牧草上均有报道。但由于ISSR-PCR是基于PCR的一种标记，其反应条件易受到各因素浓度的影响，反应体系不同也可产生不同的结果。为了确保ISSR分析结果的可靠性和重复性，进行ISSR-PCR反应体系的优化非常必要。利用ISSR分子标记技术，以国外引进的10份红三叶种质为材料，以红三叶基因组DNA为模板，采用正交实验设计[24]对ISSR-PCR反应体系进行优化，探讨反应体系中随机引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、Mg2+等的浓度以及反应的退火温度和循环次数等因子对红三叶基因组的ISSR扩增效果的影响，旨在建立一种用于红三叶的ISSR-PCR反应体系为进一步开展红三叶遗传多样性研宄奠定基础。1材料和方法1.1试验材料供试的10份红三叶材料（表1），均种植于甘肃省中部的榆中县良种场，在生长期采集新鲜叶片，于-80°C冰箱保存备用。表1试验材料及来源TableIThesampledmaterialsandsource序号名称来源1ZXY2008-P4596俄罗斯2ZXY2008-P4718俄罗斯3ZXY2008P-4820俄罗斯4ZXY2008P-4847俄罗斯5ZXY2008P-4858俄罗斯6ZXY2008P-4907俄罗斯7ZXY2008P-4914俄罗斯8ZXY2008P-4924俄罗斯9ZXY2008P-4996俄罗斯10ZXY2008P-5004俄罗斯1.2试剂TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCRBuffer、引物、MgCI2、Maker均来自上海生工。ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）提供的ISSR引物序列，由上海生物工程有限公司合成。1.3基因组DNA的提取与检测采用改良的CTAB法［25］提取红三叶叶片总DNA,用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质量，并用GeneSpec核ng/uL,-20°C保存备用。1.4ISSR-PCR正交试验设计在PCR反应体系建立过程中，dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度以及TaqDNA聚合酶用量、退火温度和循酸检测DNA质量浓度。最后将样品稀释为20环次数等均影响PCR扩增结果。针对TaqDNA聚合酶用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度等4个主要因素，选用L16（44）正交...