反义多重耐药性基因抑制眼睫状体非色素上皮细胞容积激活性氯电流［摘要］目的：研究多重耐药性(MDR1)基因及其产物P糖蛋白(P-gp)与容积激活性Cl-电流的关系。方法：用膜片钳全细胞记录技术记录牛眼睫状体非色素上皮(NPCE)细胞容积激活性Cl-电流，反义寡核苷酸阻抑细胞MDR1基因表达，在激光共聚焦显微镜下检测细胞P-gp免疫荧光。结果：P-gp免疫荧光与人源反义MDR1呈剂量依赖性减弱关系,容积激活性Cl-电流被人源反义MDR1特异性地部分阻抑，电流潜伏期延长，峰电流值减少，电流抑制率与人源反义MDR1呈现剂量依赖性增强关系,(r=0.99，P＜0.01)。P-gp表达抑制率和容积激活性Cl-电流抑制率高度正相关(r=0.99，P＜0.01)。结论：MDR1基因及其产物P-gp参与NPCE细胞容积激活性Cl-电流的形成。［主题词］离子通道；寡核苷酸类，反义;抗药性;基因表达［中分类号］Q25［文献标识码］A［文章编号］1000-4718(2000)07-0658-05Multidrug-resistanceantisenseinhibitsvolume-activatedchloridecurrentinnon-pigmentedciliaryepithelialcellsCHENLi-xin,WangLi-wei(DepartmentofPhysiology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023,China)［Abstract］AIM：Tostudytherelationshipbetweenmultidrug-resistance(MDR1)geneproductP-glycoprotein(P-gp)andthevolume-activatedchloridecurrent.METHODS:Thevolume-activatedchloridecurrentinbovinenon-pigmentedciliaryepithelialcellswasrecordedusingawholecellrecordingtechnique.AnantisensetechniquewasusedtoinhibittheexpressionofMDR1gene.TheimmunofluorescenceofP-gpwasmonitoredwithareal-timelaserconfocalmicroscope.RESULTS:P-gpimmunofluorescencecorrelatednegativelywiththeconcentrationofthehumanMDR1antisenseoligonucleotide.Theantisenseoligonucleotideinhibitedthevolume-activatedchloridecurrentspecificallyandpartially.Thelatencyofactivationofthecurrentincreasedandthepeakcurrentdecreased.Thepercentageofinhibitionofpeakcurrentcorrelatedpositivelytotheconcentrationoftheantisenseoligonucleotide(r＝0.99,P＜0.01)andtothereduction(%)ofP-gpimmunofluorescence(r=0.99,P＜0.01).CONCLUSION:P-gp,theproductofMDR1gene,playsanimportantroleintheactivationpathwayofvolume-activatedchloridecurrentinnon-pigmentedciliaryepithelialcells.［MeSH］Ionchannels;Oligonucleotides,antisense;Drugresistance;Geneexpression睫状体非色素上皮(non-pigmentedciliaryepithelium,NPCE)细胞分泌房水机制与细胞容积调节有关。NPCE容积激活性Cl-通道起着调控房水分泌速率的重要作用［1］。资料表明,多重耐药性(multidrug-resistance，MDR1)基因可能参与容积激活性氯电流的形成［2］。MDR1基因产物P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)在容积激活性氯电流的形成中的作用如何仍未确定。本研究用基因阻断技术(antisensetechnique)阻断NPCE的MDR1基因表达,观察容积激活性氯电流的改变,以阐明二者之间的关系。材料和方法一、细胞分离和培养睫状体上皮细胞分离和培养的方法见文献［3］。二、反义寡核苷酸处理细胞本实验所用鼠源和人源两种MDR1反义寡核苷酸(MDR1antisenseoligonucleotide,反义MDR1，SevernBiotechLtd,UK)用高效液相层析法提纯，其序列详见文献［3］。用阳离子脂质体lipofectin(GibcoBRL,USA)促进细胞摄取反义寡核苷酸。实验分组:空白对照组;阳离子脂质体组(lipofectin20mg/L);鼠源反义MDR1组(M-LA;lipofectin20mg/L和鼠源反义MDR1各10、50、100、200mg/L);人源反义MDR1组(H-LA;lipofectin20mg/L和人源反义MDR1各10、50、100、200mg/L)。各处理组分别在E199培养液中加入上述药物,培养48h后,进行P-gp免疫荧光标记和测定,记录全细胞电流。三、P-gp免疫荧光测定用免疫荧光法检测P-gp的水平，以了解反义MDR1阻抑MDR1基因的程度。细胞培养、处理48h后，磷酸盐(PBS)溶液漂洗细胞，聚甲醛固定，TritonX-100浸浴，羊血清封闭，JSB-1阳性对照组和处理组加入小鼠抗P-gp抗体JSB-1(Monosan,Netherlands),置于冰箱中过夜(14～16h)。J...