动物病原微生物的常规实验室检测方法简述随着我国动物养殖业的飞速发展，动物传染病逐渐呈现出非典型性症状和混合感染的征状日趋严重，许多病例仅靠临床和病理诊断很难进行确诊，而实验室检测已逐渐成为动物病原微生物确诊的依据。目前，动物病原微生物实验室检测经常使用的方法主要包括病原学诊断，血清学诊断、分子生物学诊断。本文对动物病原微生物的实验室诊断方法进行简要的概括，为实验室诊断的初学者提供一些参考。1病原学检测1.1涂片镜检对于送检样品首先一般要进行涂片镜检，首先将样品涂片，然后根据临床诊断疑似感染病原情况进行染色，常用的染色方法主要有革兰氏染色、美蓝染色、姬姆萨染色和抗酸性染色法等，最后在光学显微镜下观察微生物形态，得出初步的结论。对于疑似的病毒性感染需要进行电镜观察，电镜是以电子束来代替可见光束，观察物体时，分辨率就没有波长要在可见光谱之内的限制，因此其放大倍数和分辨率都比光学显微镜高得多。病毒颗粒极其微小，在17-300nm之间，光学显微镜无法观察，只有电镜才可以发现其形态。1.2分离培养病原分离是病原微生物检测应用较广泛的方法，细菌、真菌、螺旋体和支原体需要将样品处理后接种到其特定的培养基中进行扩增培养，然后划线或涂到固体培养基上进行分离培养，通过其生长形态、生化特性作出鉴定。立克次体、衣原体、病毒则需要将样品接种到鸡胚或特定的细胞分离病毒，通过病变情况鉴定病原。分离培养需要的时间较长，且分离的病原可能不是致病主要因素，但是它是病原微生物的基本鉴定方法，是病原学检测的基础。1.3动物接种将样品处理后或分离培养的病原根据其不同的特性接种对待检病原敏感的实验动物，通过观察其是否发病和发病症状来进行判断，甚至还可以对发病实验动物继续分离培养病原。2分子生物学检测2.1PCR多聚酶链式反应，是目前病原检测的最常用的分子生物学技术，具有高敏感性的特征，即使少量的感染也可以检出，同时该方法也是许多其它检测方法的基础。其原理是将样品的基因组DNA提出，在加热条件下，DNA双链变性分离为单链，加入合成的保守区域的特异性引物，在合适的温度下和耐热聚合酶的作用下引导DNA的合成，循环重复后即可得到大量的目的基因片段，经电泳可以检测。RNA病毒需要提取的是RNA，反转录生成DNA后再进行PCR，即为RT-PCR检测。目前，PCR技术发展已日趋完善，像实时荧光PCR、套式、多重、降落PCR已逐渐成为实验室常规检测手段。2.2核酸杂交核酸杂交技术是较早的应用于病原微生物的检测技术，首先从样品中提取核酸（DNA或RNA），将此核酸进行变性处理后固定在固相载体上，加入带有特殊标记物的探针，利用碱基互补原理结合并固定探针，借助探针上标记的物质可以了解到是否有探针甚至有多少探针被固定上去，再由此推知样品中是否含有、甚至含有多少病原微生物。根据杂交核酸的不同，又可分为Southern印迹法(检测DNA)及Northern印迹法(检测RNA)。此外，斑点和原位杂交也是常用病原检测技术。2.3基因芯片基因芯片技术在分子病原检测领域显示出了强大的生命力，主要是因为它具有微型化、集约化、标准化高通量的的特点。它的基本原理是将大量相似病原的基因保守片段的寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品或其PCR产物进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量，特别适合数量较多的样品的鉴别诊断，在规模化养殖生产中非常具有应用前景。2.3序列测定序列测定耗时较长，但是比其它方法更为可靠，是确诊的依据。测序分为全序列测定和保守区域的测定，全序列测定主要是一些核酸序列较短的病毒，但有时为了对病原进行序列分析，有的细菌、支原体、衣原体等也进行全序列测定，但耗费巨大。3血清学诊断机体受致病病感染后，其免疫系统被刺激后发生免疫应答而产生特异性抗体，用已知的特异性抗原检测患者体液中有无相应特异抗体及其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。一般采取动物的血清进行试验，故称为血清学诊断。3.1ELISA又称酶联免疫吸附试验，是最常用的血清学诊断方法。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，结合在固相载体表面的抗原或抗体...