黄芪建中丸微生物限度检查法验证试验【摘要】目的：建立黄芪建中丸的微生物限度检查法并对其进行验证，保证微生物限度检查方法的科学性以及检验结果的准确和可靠性。方法：按《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法项下方法对5种规定试验菌株的回收率进行测定，对控制菌的检查法进行验证。结果：黄芪建中丸对大肠埃希菌、黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌无抑菌活性，回收率均不低于70%。控制菌的验证试验中，两种阳性控制菌大肠埃希菌、大肠菌群生长良好，阴性菌对照组未检出阳性对照菌。结论：确认了黄芪建中丸的微生物限度的检查方法，即用常规法检查黄芪建中丸的细菌霉菌酵母菌和控制菌结果可靠。【关键词】方法验证；微生物限度检查；培养基稀释法【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】1671-8725（2014）11-0144-02建立黄芪建中丸的微生物限度检查法进行方法验证，以保证其微生物限度检查方法的科学性和准确性。黄芪建中丸主要由黄芪、肉桂、白芍、甘草、大枣五味组成，具有补气散寒，健胃和中的功效。用于脾胃虚寒所致的恶寒腹痛，身体虚弱。在建立黄芪建中丸的微生物限度检查法时采用<<中国药典>>2010年版一部附录微生物限度检查法对细菌霉菌和酵母菌计数方法验证，对规定的5种试验菌的回收率逐一进行验证及控制菌的检查方法验证，以证明所采用的方法适合于该药物微生物检查方法。1试验材料1.1试验环境在环境洁净度万级，局部洁净度百级的单向流空气的无菌室中进行。1.2培养基：营养琼脂培养基（批号090113）玫瑰红钠琼脂培养基（批号080522）胆盐乳糖培养基（批号090110）胆盐乳糖发酵培养基（批号090110）营养肉汤培养基（批号080612）改良马丁培养基（批号081105）MUG培养基（批号08080）曙红亚甲蓝琼脂培养基（批号08080）1.3试验菌株大肠埃希菌［CMCC(B)44102］金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］白色念珠菌［CMCC(F)98001］黑曲霉菌［CMCC(F)98003］上述培养基各菌株均有中国药品生物制品检定所提供。2实验部分（一）细菌，霉菌及酵母菌计数方法的验证2.1菌液制备2.1.1取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，35℃～37℃培养18h～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每ml含菌数为50cfu～100cfu的菌液备用。2.1.2取白色念珠菌的新鲜培养物接改良马丁培养基中，23℃～28℃培养的24h～48h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至菌液浓度为每1ml含菌数50cfu～100cfu。2.1.3接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23℃～28℃培养5d～7d，加0.9%无菌氯化钠溶液3ml～5ml洗下霉菌孢___________子，吸出孢子液，取1ml孢子液至0.9%无菌氯化钠溶液9ml中，使菌液浓度为50cfu/ml～100cfu/ml。2.2供试液的制备取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1∶10的供试液。2.3试验方法2.3.1药典常规法，取1毫升供试液注皿，分别加入五株试验菌，测定回收率。2.3.2培养基稀释法，取0.2毫升供试品，分别加入五株试验菌，测定回收率。2.4回收率测定2.4.1菌液组分别取已制备好的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌黑曲霉、白色念珠菌的菌液1ml(含50～100cfu)，采用平皿计数法，含金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的实验平皿倾注营养琼脂培养基，每株试验组平行制备2个平皿，置30℃～35℃培养48h，计数;白色念珠菌、黑曲霉的实验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验组平行制备2个平皿，置23℃～28℃培养72h，计数。测定菌液中每毫升的活菌数。2.4.2供试品对照组取1∶100供试液1ml，倾注营养琼脂培养基，每株试验组平行制备2个平皿，置30℃～35℃培养48h，测定供试品本底的细菌数;取1∶10供试液1ml，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验组平行制备2个平皿，置23℃～28℃培养72h，测定供试品本底的霉菌和酵母菌数。2.4.3试验组取1∶100的供试液1ml和上述细菌菌液1ml(含50cfu-100cfu实验菌)，分别注入同一平皿中，倾注营养琼脂培养基，置30℃～35℃培养48h，每株试验组平行制备2个平皿，进行细菌计数和回收率计算。取1∶10的供试液1ml...