农杆菌浸种对甘蓝种子萌发及幼苗生长的影响摘要：采用不同D600nm值的农杆菌菌液浸泡甘蓝种子，研究农杆菌浸种对甘蓝种子萌发及幼苗生长发育的影响，并检测其转化效果。结果发现，农杆菌浸种对甘蓝种子的发芽率、发芽指数、活力指数均有抑制作用，且D600nm值越高，抑制作用越明显。此外，农杆菌浸种对甘蓝幼苗的株高、叶面积、根茎比、鲜质量均有显著抑制作用。叶绿素含量随D600nm值增大，呈先增加后降低的趋势，D600nm为0.8时，叶绿素含量最高，为7.86mg/g，D600nm为1.6时，叶绿素含量最低，为5.64mg/g。农杆菌浸种不影响SOD活性，但POD、CAT活性均随着D600nm值的升高而升高。农杆菌浸种能获得一定的PPT抗性苗，其中D600nm为0.8时获得的抗性苗最多，达到10.32%。PCR结果显示农杆菌浸种能实现基因的转化，其中D600nm为1.6时转化率最高，达到2.33%。关键词：甘蓝；农杆菌浸种；种子萌发；幼苗；转化：S635.04文献标志码：A：1002-1302（2015）03-0139-03农杆菌介导的遗传转化是目前较广泛应用的转基因方法，但是常规的农杆菌介导法依赖于组织培养[1-2]，导致其应用受到一定的限制。农杆菌浸种法是近年诞生的一种转基因方法，是将萌发的种子直接浸在农杆菌菌液中，利用农杆菌的浸染特性和植物细胞自身的物质转运系统把外源基因导入受体细胞并整合到基因组中稳定表达，从而实现遗传转化[3]，如Feldmann等首次利用农杆菌浸种法将npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因导入了拟南芥[4]，该方法后来相继在水稻、小麦、黄瓜、番茄、中华结缕草等植物遗传转化中取得了成功[5-8]。甘蓝的遗传转化研究起步早，目前已相继导入抗虫基因Bt、蛋白酶抑制剂基因、育性基因、抗病基因、生长素基因等[9]。纵观甘蓝的遗传转化，最常采用的方法还是依赖于组织培养的农杆菌介导的遗传转化，笔者所在实验室采用该传统的转化方法获得了部分激活标签突变体[10]，但是转化效率低下，且需要在无菌条件下进行离体操作。因此，本研究将采用农杆菌浸种法，将含激活标签pSKI015的农杆菌转化甘蓝，调查浸种对甘蓝种子萌发及幼苗生长的影响，并探讨其转化效果，以期获得一种甘蓝激活标签突变体材料的简便转基因方法。1材料与方法1.1供试材料供试甘蓝为夏光种子，供试农杆菌为GV3101（含质粒pSKI015）。1.2农杆菌的培养用LB培养基接种农杆菌，28℃、220r/min振荡培养过夜，分光光度计测定600nm下的D值。1.3农杆菌浸种取成熟饱满发芽率85%以上的种子，用0.4%KMnO4浸种6min，无菌水冲洗3～4次，25℃催芽。待种子80%露白时，再用无菌水冲洗干净，加入农杆菌液，农杆菌菌液D600nm分别为0（未加入农杆菌的LB溶液，对照）、0.4、0.8、1.2、1.6。浸种2h，倒掉菌液，25℃黑暗条件下培养2d后转入铺有滤纸的培养皿（滤纸使用1mg/L的PPT浸湿，适时补加），置于20℃、14h/d光照的培养箱中培养，观察记载发芽情况。1.4幼苗移栽种子发芽后统计发芽率、发芽势、活力指数。用自来水将幼苗冲洗干净，移栽于穴盘培养。1.6生理指标测定取移栽30d的苗，测定各生理指标[11]。采用丙酮提取法测定叶绿素含量，氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性，愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性。1.7PPT抗性苗筛选浸种后的种子播种在含1mg/LPPT的培养皿中发芽，移栽穴盘后后喷施10mg/LBasta溶液。1.8PCR检测CTAB提取PPT抗性苗叶片基因组DNA，以BarF（5′-TCGACTCTAGCGAATTC）和BarR（5′-ATAGGCGTCTCGCATATCTC）为引物扩增长度为700bp的bar基因，未转化的甘蓝为阴性对照，pSKI015为阳性对照，扩增方法和程序参照王爱荣等的方法[12]。PCR反应总体积25μL。扩增程序：5℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s，30个循环；72℃延伸5min。取扩增产物10μL于1%琼脂糖凝胶上电泳。1.9数据处理用SPSS系统软件进行数据处理，MicrosoftExcel软件作图，P<0.05作为显著性检测标准。2结果与分析2.1农杆菌浸种对甘蓝种子萌发的影响由表1可知，随着农杆菌D600nm的升高，甘蓝种子发芽率基本呈现下降趋势，其中D600nm为0.4时，与对照差异不显著，但是D600nm为0.8、1.2、1.6时的发芽率显著低于对照，D600nm为1.6时...