食品安全国家标准食品中维生素K1的测定1范围本标准规定了食品中维生素K1的测定方法。本标准第一法为高效液相色谱—荧光检测法，第二法为液相色谱—串联质谱法，均适用于婴幼儿食品、乳品、植物油、水果和蔬菜中维生素K1的测定。第一法高效液相色谱—荧光检测法2原理高脂样品经脂肪酶酶解，高淀粉样品经淀粉酶酶解，正己烷提取样品中的维生素K1后，用高效液相色谱C18柱将维生素K1与其他杂质分离，锌柱柱后还原，荧光检测器检测，外标法定量。果蔬等低脂性植物样品，用异丙醇分散后，正己烷提取其中的维生素K1，经中性氧化铝柱净化，去除叶绿素等干扰物质。用高效液相色谱C18柱将维生素K1与其他杂质分离，锌柱柱后还原，荧光检测器检测，外标法定量。3试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1无水乙醇（CH3CH2OH）。3.1.2碳酸钾（K2CO3）。3.1.3无水硫酸钠（Na2SO4）。3.1.4异丙醇（C3H8O）：色谱纯3.1.5正己烷（C6H14）。3.1.6甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.7四氢呋喃（C4H8O）：色谱纯。3.1.8乙酸乙酯（C4H8O2）。3.1.9冰醋酸（CH3COOH）：色谱纯。3.1.10氯化锌（ZnCl2）3.1.11无水乙酸钠（CH3COONa）。3.1.12氢氧化钾（KOH）。3.1.13磷酸二氢钾（KH2PO4）3.1.14脂肪酶：酶活力≥700U/mg。3.1.15淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。3.1.16中性氧化铝：装层析柱用，100目~200目。3.1.17中性氧化铝柱※：2g/6mL，填料中含10%水，可直接购买商品柱，也可自行装填。※注：中性氧化铝柱装填方法：填料处理：取200克中性氧化铝于500mL的广口瓶中，于150℃干燥箱中烘烤2h，加盖后于干燥器中冷却至室温，缓慢加入20mL纯水，边加边摇，加完后加上瓶盖，放入80℃烘箱中平衡3~5min，取出后，剧烈振摇，直至瓶内氧化铝自由流动，无结块，置于干燥器中冷却30min，备用。层析柱装填：取6mL的针筒式柱套，加入筛板，称取2.00g上述经脱活化处理的填料，再加入一块筛板，用装填工具压紧。3.1.18锌粉：粒度50µm～70µm。3.1.19锌柱※：50mm×4.6mm，锌柱可直接购买商品柱，也可自行装填。※注：锌柱填装方法：将锌粉密集装入还原柱（4.6mm×50mm，不锈钢材质）中。装柱时，应连续少量多次将锌粉装入柱中，边装边轻轻拍打，以使装入的锌粉紧密。锌柱接入仪器前，须将液相色谱仪所用管路中的水排干。3.2试剂配制3.2.1氢氧化钾溶液（40%，质量分数）：溶解40g氢氧化钾于100mL水中。3.2.20.8mol/L的磷酸盐缓冲液（pH=7.9-8.0）：溶解54.0g磷酸二氢钾于300mL水中，用氢氧化钾溶液调节pH到7.9-8.0，加水定容到500mL。3.2.3正己烷-乙酸乙酯（90:10，V/V）溶液：取90mL的正己烷，加入10mL的乙酸乙酯，混匀。3.2.4流动相：甲醇900mL，四氢呋喃100mL，冰醋酸0.3mL，氯化锌1.5g，无水乙酸钠0.5g，溶解后用0.45µm有机系滤膜过滤于干燥试剂瓶中。3.3标准品3.3.1维生素K1标准品（C31H46O2，CAS：84-80-0）：纯度≥99%。3.4标准溶液配制3.4.1维生素K1标准贮备溶液：（1mg/mL）：称取0.05g（精确到0.1mg）维生素K1标准品于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。此溶液浓度约为1mg/mL。将溶液转移至试剂瓶中后，在-20℃下避光保存。临用前进行浓度校准（校准方法参见附录A.1）。3.4.2维生素K1标准中间液（10µg/mL）：取标准贮备液1.00mL，加甲醇定容至100mL。3.4.3标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素K1中间液10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、400μL，加甲醇定容至10mL，维生素K1标准系列工作液浓度分别为10μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L，200μg/L，400μg/L。4仪器和设备4.1匀浆机。4.2高速粉碎机。4.3组织捣碎机。4.4涡旋混合器。4.5恒温水浴振荡器。4.6pH计：测量精度±0.02。4.7天平：感量0.01g和0.00001g。4.850mL具塞PVC离心管。4.9离心机：转速≥6000转/min。4.10定量移液管：5.0mL，10.0mL，20.0mL。4.11玻璃试管：10mL。4.12旋转蒸发仪。4.13氮吹仪。4.14超声波震荡器。4.15一次性微孔滤头：带0.22μm微孔滤膜。4.16高效液相色谱仪：带荧光检测器。4.17色谱分离柱：C18柱（4.6mmX250mm,粒径5μm），或相当者。5分析步骤5.1试样制备将一定数量...