微生物学报ActaMicrobiologicaSinicaHIV-1缺损慢病毒载体的高滴度制备及其介导的高效基因转移曾令兵123,张林1,孟彥1,YuananL『，叶林柏3('中国水产科学研究院长江水产研究所荆州434000)(2RelrovirologyRt^eaichLxdx)ratoiy,PacificBiosciencesResearchCenter,UniversityofHawaiiatMaiioa,IIonolulu,Hawaii96822,USA)C武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室武汉430072)摘要:近來,慢病毒载体引起了极大关注，己成为转基因操作中垂要的工具o用编码病毒纽份的三质粒系统共转染293T包装细胞系，建立了大量制备HIV-i缺损慢病毒载体的方法,病毒载体的度可达到1.1x107IU/n)L,离心浓缩可将载体滴度提高100倍以上。H1V-1缺损慢病潯载体可以高效转导人淋巴瘤等多种來源的细胞,RT-PCR检测显示外源基因GFP稳定表达达18个月以上,长期传代观测未检出］)24抗原蛋白或可复制病毒。关键词：HIV-1慢病毒载体，制备，高滴度，基因转移，效率:Q786，Q934・2文献标识码：A文章编0(X)1-6209(2007)06-1060-06在人类疾病基因治疗和转基因动植物研究中,载体或基因转移系统冇着十分重要的地位⑴。于多种病毒的载体，如逆转录病毒、腺病毒、腺联病毒、杆状病毒以及疱疹病毒等，日益受到人们的重视2。在这些病毒载体中，于人免疫缺陷病毒1型(HW-1)的慢病毒载体因其具有转移基因容量大、转导效率高以及可将外源基因整合至靶细胞基因组实现外源基因持续稳定表达等特点，已被广泛应用于多种细胞的转基因研究，如肝细胞⑷、造血细胞°、人胚胎干细胞'、淋巴细胞％、单核细胞/巨噬细胞⑺以及神经细胞「等。为了更进一步探索HIVJ缺损慢病毒载体作为基因治疗和转基因载体的潜力，有必要建立高效稳定地制备高滴度病毒载体的方法，以及对载体转导不同细胞的能力、可复制病毒的检测以及转导细胞中外源基因表达等进行研究。本文报道了这一研究的结果。1材料和方法1.1材料1.1.1主要试剂和仪器：生物安全柜(SterilGARDHood,ClassIITypeA/B3,BakerCo.Inc.)；荧光倒置显微镜(Olympus1X70)；PCR扩增仪(GeneAmp9700,ABI)；二氧化碳培养箱(FormaScientific)；紫外分光光度计(BeckmanDU640)；凝胶成像系统(Bio-Rad,ChemiIX)CXRS)；超速离心机(Becknuin-CoulterOptimaLE-80K)；低速冷冻离心机(CentraGP8R,IEC)培养基MEME(MinimumEssentialMediumEagle's)、DMEM(Debecco'sMininnimEssentialMediumEagle)、RPMI・1640、两性毎素B、青霉素/链程素、Dull)ecco,s磷酸盐缓冲液(DPBS)、L■谷胺酰氨、胰蛋白酚-EDTA(Typsin-EDTA)、IIEPES、异丙醇、氯奎等均购自Signia公司;质粒DNA提取和总KNA提取采用Qiagen试剂盒;卩24抗原蛋白酶免疫检测试剂盒为CoulterBeckman产品;精制胎牛血清(DefinedFetalBovineSemm,DFBS)为Hyclone产品。1.1.2质粒:采用三质粒系统制备HIV・1缺损慢病毒载体，即包装质粒、转移质粒以及外膜质粒。质粒材料由Rochester大学V・Planelles教授惠赠"丿°包装质粒pCMVAR8.2Avpr去除了H1V・1所有顺式作用元件和•基因，反式提供载体所需要的病毒结构蛋白，启动子于巨细胞病毒(CMV)o转移质粒DHIV-Rev-RRE+除去了病毒的结构蛋白gag>pol、env基因以及附属基因vif、vpr>nef,并失活了Rev的第二个外显子，保留有包装信号等顺式元件，插入了绿色荧光蛋白报告基因，启动子为IIW-1的长末端重复序列LTRo外膜质粒pCMV-VSV-C为表达滤泡性口膜炎病毒G蛋白(VSV-G)的质粒，启动子来源于巨细胞病毒(CMV),使载体包装后形成假性病毒。所有质粒用Qiagen试剂盒制备，BeckmanDU-作者简介：曾令兵(1962-),男，湖北仙桃人，博士，研究员，从事鱼类病害基础理论与防治技术研究。Tel:86-716-8115716；E-mail:zenglingl)ing@ginail・com收稿日2007-03-06;接受日:2007-04-30：修回日期：2007・07・14640紫外分光光度计测定质粒DNA浓度。1.1.3细胞：人T4淋巴母细胞瘤细胞系CEM-ss>非洲绿猴肾细胞系COS-7及非霍京氏T淋巴瘤细胞系Sup-Tl使用含10%DFBS的RMP1-1640培养基培养;人胚肾细胞系293T、鼠胚胎细胞系NIH3T3、人T细胞白血症细胞系MT-2以及鼠胚胎杂交瘤细胞系PA-317用含10%DFBS的DMEM培养基培养；猴肾细胞系Ver。、人子宫颈上皮腺瘤细胞系Ileb、人肺纤...