HIF1α基因表达下调对人结肠癌SW480细胞增殖和VEGF表达的影响【摘要】目的:研究转录因子缺氧诱导因子1α（HIF1α）在缺氧条件下对人结肠癌SW480细胞增殖的作用，以及HIF1α对血管内皮生长因子（VEGF)表达的影响，研究HIF1α调节SW480细胞增殖的机制.方法:构建针对HIF1α的pSuperEGFPsiRNA表达载体，转染SW480细胞，抑制HIF1α的表达，RTPCR和WesternBlot检测抑制结果；MTT法检测HIF1α被抑制后，SW480在缺氧培养条件下的增殖情况；RTPCR和WesternBlot检测VEGF的表达.结果:缺氧培养条件下，HIF1α和VEGF表达明显上升；转染pSuperEGFPsiRNA表达载体后，SW480细胞HIF1αmRNA和蛋白质的表达大幅下降；SW480细胞增殖下降（P《0.05）；而在缺氧培养条件下有较高表达的VEGF，其mRNA和蛋白质的表达也大幅下降.结论:HIF1α在缺氧条件下，对SW480细胞在增殖有影响，其机制可能是通过在缺氧时上调节VEGF等细胞生长因子的表达，进而调节肿瘤细胞生长.【关键词】缺氧诱导因子血管内皮生长因子类RNA干扰SW480细胞增殖0引言缺氧诱导因子1(hypoxiainduciblefactor1,HIF1)是调节肿瘤细胞缺氧反应的主要转录因子.HIF1α是决定HIF1活性的亚单位，其在许多肿瘤中高表达，与肿瘤高度侵袭性、易转移、对放化疗不敏感和预后不良密切相关［1］；同时HIF1α与肿瘤细胞增殖、细胞凋亡、糖代谢、血管生成有紧密联系［2］.以HIF1α为靶点的抗肿瘤治疗正成为许多基础和临床研究的热点.RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种封闭基因表达的有效方法.为探讨以HIF1α在SW480细胞增殖中的作用，及以HIF1α靶点的RNA干扰对结肠癌的作用,我们构建了针对HIF1α的短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）表达载体，抑制其表达，研究HIF1α表达被抑制后，SW480细胞增殖及其VEGF表达的变化.1材料和方法1.1材料脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；兔抗HIF1α多克隆抗体、VEGF多克隆抗体购自SantaCruz公司，羊抗兔HRP二抗购于北京中杉金桥公司；逆转录试剂盒和T4DNA连接酶购自MBI公司；Tag聚合酶和TRIZOL试剂购自Gibco公司；蛋白酶抑制Cocktail购于Sigma公司；PVDF膜购自Millipore公司；ECL试剂盒购于Pierce公司；HIF1α靶shRNA和无义对照的DNA寡核苷酸链和PCR引物由博士德公司合成；pSUPEREGFPsiRNA表达载体由第三军医大学陈春霖博士赠送.SW480细胞株由四川大学华西医院肿瘤生物治疗研究室赠送.1.2方法1.2.1细胞常氧和缺氧培养SW480细胞在含100mL/L小牛血清的RPMI1640中培养（37℃，210mL/LO2，740mL/LN2，50mL/LCO2）；低氧条件建立：将生长状态良好的SW480细胞置于三气培养箱中低氧培养(10mL/LO2，50mL/LCO2，940mL/LN2)，模拟肿瘤组织缺氧微环境.---本文于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---1.2.2人HIF1αsiRNA表达载体的构建根据文献［3］报道，合成构建人HIF1αsiRNA表达载体的一对互补19nt寡核苷酸链，两端带有BglII和HindIII酶切位点.siRNA和无义对照序列都在GenBankdatabase进行BLAST检索，所设计的siRNA序列仅仅与人HIF1α序列相配，而无义寡核苷酸对照链顺序不与任何人基因序列相配.将正义和反义寡核苷酸链各1nmol在50μL退火缓冲液中退火，退火程序按95℃4min，70℃10min，缓慢冷却至室温，形成带酶切位点的寡核苷酸双链.取0.02nmol退火双链与200ngpSUPEREGFP载体，在含T4DNA连接酶的20μL反应体系中，室温连接6h.重组体转化DH5α感受态细菌，筛选Kan+抗性克隆，抽提质粒，BglⅡ和HindⅢ双酶切后琼脂糖电泳检测，测序分析验证.1.2.3细胞转染和筛选SW480细胞计数1×105接种于六孔板，培养至90%融合，在LipofectamineTM2000脂质体介导下进行HIF1αshRNA表达载体和无义shRNA表达载体的转染，空白对照组孔内加入含相同浓度脂质体的RPMI1640培养液.6h后移去含脂质体的培养液，换为含100mL/L血清的RPMI1640培养液继续培养.48h恢复生长后，用含200g/LG418的培养液筛选6d，再用含G418400mg/L的培养液筛选3d，换含200g/LG418的培养液继续扩大培养，进行后续操作或冻存.1.2.4半定量RTPCR检测TRIZOL法提取...