caspase-3在颈椎稳定性异常小鼠脑组织中表达的变化及其意义(闩城医学高等专科学校吉林闩城137000)【屮图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】1007-8231(2016)26-0086-02颈椎病是开始于单个或多个颈椎间盘的进行性退行性病变，并可导致周围骨和软组织的结构改变，影响相关血管、神经根或/和脊髓，患者常伴头痛、血压升高、心率增快，老年病人常伴组织器官衰老病症。为深入探讨颈椎稳定性异常导致脑细胞凋亡机制，采用免疫组化、逆转录聚合酶链反应和Westernblot观察caspase-3蛋白在在小鼠颈椎稳定性异常病理模型［1］脑组织屮的表达变化，探讨颈椎稳定性异常与AD发病的分子生物学机制。1.主要试剂配置和方法1.1主要试剂的配制PBS溶液：称取8g氯化钠、0.2g氯化钾I、1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾溶于800ml蒸馏水，用HCI调节溶液pH值至7.4,加蒸馏水定容至1L。0.01M拧檬酸缓冲液：3g拧檬酸三钠+0.4g柠檬酸溶入1000ml蒸馏水，用0.1M氢氧化钠溶液调定pH至6.0。4%多聚甲醛溶液：40g多聚甲醛溶于lOOOmIPBS溶液，加热溶解。DAB配制：1ml蒸馏水屮加入一滴浓缩缓冲液，均匀混合；滴加DAB溶液和浓缩过氧化氢溶液各一滴，再次混匀，避光保存，30分钟内使用。Hams苏木素染色液.•用200ml蒸馏水加热溶解15g硫酸铝钾，用10ml无水乙醇溶解lg苏木精，再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水屮，煮沸1分钟后，稍冷却，慢慢加入0.5g红色氧化汞，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶门，用前滤纸过滤后每100ml加冰醋酸10ml。1.2RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳1.2.1总RNA提取每组取双侧海马和皮层组织各lOOmg(每组4只小鼠，每只鼠---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---取25mg)置5ml离心管，加lml预冷异硫氰酸胍变性溶液，匀浆。力nO.lmlNaAc(2mol/L,pH4.0),lml酸-氯仿-异丙醇混合液，震荡，4'ClOOOOg离心20min。吸取上清，加等容积异丙醇,-20°C放置2h以上，4°Cl0000g离心15min。吸去上清。向沉淀中加0.5ml变性溶液，搅拌至RNA溶解。加NaAcO.O5ml,酸-氯仿-异戊醇混合液0.5ml,震荡，4'ClOOOOg离心20min。上层水相转移到1.5ml离心管中，加等容积异丙醇，-2CTC放置2h以上，4°C、lOOOOg离心15min。以预冷的75%乙醇5ml洗涤沉淀，并按前法离心。吸去乙醇，在真空干燥器中干燥沉淀15min，用0.3〜0.5mlDEPC水溶解RNA沉淀。紫外分光光度计测定(260/280)nm吸光值，估算RNA样品纯度。RNA浓度(μg/ml)=OD260值×40μg/ml×稀释倍数。1.2.2引物设计从Genebank中找到小鼠Capase-3的全长cDNA序列，并利用Primer5.0和Oligo6.0软件设计引物。以β-actin做内参用于RT-PCR。经检验引物内部无发夹结构，引物之间无二聚体形成，引物与基因库之间无非特异性同源区域。1.2.3逆转录反成合成cDNA在0.5mlEppendorf管中加入：①取总RNA10μg加DEPC水至12.5μl；②加入Olig-dT(lμg/μl)2.5μh③混匀后置65°C水浴10分钟，冰浴2min;④另取一个0.5mlEppendorf管加入5×RT-bufferl0μl,dNTP(10mM)2.5μl,MMLV(100U/μl)2.0μl,火活DEPC水21.5μl;⑤将④混匀后加入③中，42°C水浴lh，70°C水浴10分钟火活逆转录酶；⑥逆转录所得cDNA模板放于-20°C保存备用。1.2.4PCR反应扩增设置反应程序:94°C变性1分钟,55°C退火1分钟，72°C延伸1.4分钟，共34个循环，最后72°C延伸10分钟。反应总体积25μl：cDNA2.5μl，2×TaqPCRPlusMixl2.5μl,primerl.0μl,ddH20；9.0μl。混匀，进行PCR。反应结束后，拿出样品取5ulPCR产物在2%琼脂糖凝胶板上电泳，电压50V约---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---20分钟。电泳条带跑开后，将琼脂糖凝胶用图像分析仪行图像分析。2.结果2.1caspase-3蛋白免疫组织化学染色模型组较正常对照组脑海马、额叶和颞叶caspase-3阳性细胞数均明显增多,大小形态均一，说明颈椎稳定性异常可致脑组织caspase-3表达上调。见图1。图1小鼠脑海马区caspase-3蛋白免疫组织化学染色结果(10×40)(左正常组，右模型组)2.2半定量RT-PCR产物的电泳图谱模型组caspase-3基因表达较正常对照...