人结肠癌HCT-116细胞传代培养的简易方法王倩1徐云丹|赵刚心1、湖北中医药大学基础医学院（武汉，430065）2、湖北中医药大学中药资源与复方教育部重点实验室［摘要］目的：建立対体外培养的人结肠癌HCT-116细胞进行传代的简易方法。方法：分别使用胰酶消化法和水平震荡法进行HCT-116细胞的传代，培养48h后，对贴樂细胞进行观察和计数，比较两种方法的差异。结果：水平震荡法对HCT-I16细胞的传代效果与胰酶消化法无明显差异。结论：针对人结肠癌HCT-116细胞在体外培养吋常出现部分细胞聚团生长的特性，建立了一种简易的细胞传代培养方法——水平震荡法。该方法无需使用胰蛋白酶，避免了胰酶对细胞的损伤作用，而且操作简便，降低了实验成本和污染的风险。［关键词］HCT-116细胞；传代培养；水平震荡法作者简介：王倩（1977-）,女，讲师，医学硕士；电子邮箱：elisashop@163.com*通讯作者：赵刚（1959-）,男，教授，理学博士，硕士研究生导师；电子邮箱：zgcc66@l63.com【中图分类号】【文献识别码】【文章编号】人结肠癌HCT-116细胞是Brattain等人在1979年从一例男性结肠癌患者的癌组织中培养建立起来的低分化型腺癌细胞株⑴，广泛应用于恶性肿瘤细胞的生物学特性、抗肿瘤药物作用机理和抗癌药物的筛选等领域的研究⑺二近年的研究衣明，大多数HCT-U6细胞具有肿瘤干细胞的特性，口J作为肿瘤干细胞研究的理想対象⑸。在体外培养条件下，HCT-116细胞一•般呈梭形或多角形贴壁生长，传代培养时通常采用胰蛋白酶消化法进行。但经典的胰酶消化法传代对细胞可能产生一定的损伤，口操作相对繁琐。我们在实验时发现，HCT-I16细胞在体外培养中常出现部分细胞聚团堆积生长的现彖，U部分细胞相对容易脱落。为了简化HCT-116细胞传代培养的操作，避免胰酶对细胞的损伤，我们针对该细胞容易聚团并易脱壁的特点，建立了简单高效的水平震荡方法替代胰酶消化法对HCT-116细胞进行传代培养，收到良好的实验效果。1材料与方法1.1细胞株：人结肠癌HCT-116细胞株购自武汉大学生命科学学院中国典型培养物保藏中心。1.2试剂：PRMI-1640培养基（美国HyClone公司）、新生牛H1I•清（武汉三利生物技术有限公司）、青毒素与链霉素（华北制药股份有限公司，；0.25%胰蛋白酶消化液（美国HyClone公司）。1.3器材：电动震荡仪（浙江金坛仪器厂），倒置显微镜（CK40型，日本Olympus公司），超净工作台（YJ-875型，苏州净化设备有限公司），CO?培养箱（MCO-15AC型，日本SANYO公司，5mL可调移液器（上海大龙医疗设备有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-4型，国华电器公司），小型台式离心机（800型，国华电器公司）；一次性塑料培养瓶（T25型，日本IWAKI公司）。1.4细胞的培养：按无菌操作，将HCT-116细胞接种到含有10%的新生牛血清、100U/mL青霉素和链霉素的PRMI-1640培养基（T25型培养瓶），置恒温37°C、5%CO2.饱和湿度的二氧化碳培养箱中静證培养。每tl观察细胞的生长情况，待细胞长满培养瓶底面后用传统的胰酶消化法进行传代，共传至8瓶时进行实验。将8瓶细胞分为胰酶消化传代纽.和水平震荡传代纽.，每纽.4瓶，对HCT-116细胞进行两种传代方法的比较。1.5胰酶消化纽传代操作：往培养瓶中加入ImL胰酶，晃动培养瓶使胰酶均匀分布到细胞培养面，将培养瓶贴靠在手掌心消化lmin,然后用5mL移液器的长吸头吸去胰酶，加入含10%的新生牛血清的PRMI-1640培养液5mL终止消化；用长吸头吹打培养液lmin使贴壁的细胞脱落下来混成细胞悬液，吸収2.5mL细胞悬液转入另一只入无菌新培养瓶中，在原培养瓶中留下2.5mL细胞悬液，往两只培养瓶中各补充1640培养液2.5mL。将传代后的培养瓶置于37°C、5%CO2饱和湿度条件下静置培养，每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况。图1传代前细胞X400图2胰酶消化组传代后细胞X400图3水平震荡组传代后细胞X4001.6水平震荡纽.传代操作：往培养瓶中加入5mL培养基，盖紧瓶盖，于•握培养瓶沿水平方向快速震荡lmin,或者将培养瓶置于电动振荡器上震荡30sec,使瓶底面聚I才I堆积生长的细胞脱落下来并解离为单细胞状态。震荡结束后将培养瓶在超净台中静置5min,使震荡过程中产生的泡沫基本消散。用5mL移液器吸取瓶内的...