肠道病毒71型检测与VP1基因特征分析【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）7-0224-01【摘要】目的分析肠道病毒71型2011年本地流行株VP1基因特征学特征。方法收集2011年本地手足口病患者临床标本332份，进行EV71荧光定量RT-PCR鉴定，采用RT-PCR对15株分离到的EV71进行VP1编码区基因扩增，并对扩增产物进行核苷酸序列测序和分析。根据VP1测序结果与国内外报道的各基因型和基因亚型EV71VP1序列进行同源性和亲缘进化分析。结果165份标本鉴定为EV71，分离株的VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别是97.5%～99.9%和99.4%～100%。与C4a亚型的核苷酸和氨基酸最高。亲缘进化树显示，本地株全部属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论本地区分离的EV71与近几年国内其他地区EV71分离株亲缘关系很近，有共同进化的趋势，属于C4基因亚型的C4a进化分支，并存在多个传播链。【关键词】肠道病毒71型基因特征遗传进化手足口病（hand，footandmouthdisease，HFMD）是由多种肠道病毒引起的，严重威胁儿童健康的全球性传染病。临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹，伴有发热、咽痛、倦怠乏力等症状，个别重症患儿病情进展快，可发生死亡。为全面了解本地区手足口病病原学分布的情况，对本市446份手足口病临床诊断标本进行检测，现将结果报告如下。1材料和方法1.1标本来源2009～2010年各医院送检的HFMD临床诊断标本共332份，其中粪便、咽拭子、肛拭子、脑脊液、气管洗液标本各201、72、43、12、4份。1.2核酸提取和荧光定量RT-PCR检测采用QIAGENReansyMiniKit试剂盒，操作步骤参照RneasyMinikitHandbook。上海之江生物科技有限公司生产的肠道病毒71型荧光检测试剂盒和柯萨奇病毒A组16型荧光检测试剂盒。1.3EV71VP1基因扩增将检测为EV71阳性的病毒核酸进行全长VP1编码区的核苷酸序列测定和分析。上游引物：VP1-F：5’-GCAGCCCAGAAGAACTTCAC-3’；下游引物：VP1-R：5’-ACCACTCTAAAGTTGCCCAC-3’。该引物扩增全长1015bp的片段，采用TAKARA公司的一步法试剂盒进行基因扩增，反映条件：42℃反转录30min；95℃预变性3min，以95℃30s、58℃70s、72℃1min扩增30个循环；72℃后延伸10min。使用1%琼脂糖凝胶电泳观察是否出现预期的PCR产物。1.4VP1基因序列测定与分析利用ABI3730全自动基因测序仪对EV71VP1基因序列进行双向核苷酸序列测定，测序结果使用DNAstar生物软件进行分析处理，参考株基因序列来自GENBANK。2结果2.1流行病学概况和病原检测结果2011年共检测本市HFMD病例各类标本332份，检测到总肠道病毒核酸阳性278份，总检出率为77.58％；男性167份，女性111份，发病人群主要集中在1-5岁年龄组，有较明显的季节性，发病主要集中在4～7月。EV71病毒核酸阳性165份，检出率59.3%；CoxA16病毒核酸阳性98份，检出率35.25%；其他肠道病毒15份，检出率5.39%。EV71的检出率高于CoxA16和未分型标本。2.2VP1序列测定和同源性分析结果从以上EV71阳性标本中选出15份代表性样本进行基因扩增和序列测定，结果显示15株EV71VP1区核苷酸序列长度都是891bp，编码297个氨基酸。本研究的15份EV71在VP1区核苷酸和氨基酸同源性很高，核苷酸和氨基酸同源性分别在97.5%～99.9%和99.4%～100%之间；与基因库（GenBankDatabase）检索到EV71代表株VP1序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析，本地区EV71的VP1区与C4基因亚型核苷酸和氨基酸同源性在92.1%～99.8%和96.4%～100%之间；与C4a基因亚型的核苷酸和氨基酸同源性最高在93.8%～99.5%和98.2%～100%之间；与A、B型的核苷酸和氨基酸同源性较低；与CoxA16核苷酸和氨基酸同源性最低。进行序列位点分析发现本地流行株有几个位点发生了变异，VP1第22位组氨酸变成了谷氨酰胺，第164位由天冬氨酸变成了谷氨酸，269位由谷氨酰胺变成脯氨酸。2.3VP1蛋白遗传进化分析根据EV71的VP1编码区核苷酸序列，运用Mega5.0软件将本研究的EV71与基因库检索到EV71代表株构建亲缘进化树。EV71分为—A、B、C3个基因型，本地区15株EV71均于C4基因亚型聚成一簇，在亲缘进化树图上看出，本地流行株属于C4基因亚型的C4a进化分支，并存在多个传播链，传播链的分布呈现样本收集的地域相关性，推测本地区EV71...