小鼠B7-2基因的克隆、测序及其重组质粒的构建杨建征，金光辉，田梅，潘雪娜，金顺子，刘树铮*（吉林大学卫生部放射生物学重点实验室，吉林长春）[摘要]目的：克隆小鼠B7-2基因编码区的cDNA序列，并构建其表达载体。方法：利用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法，以小鼠脾细胞mRNA为模板，扩增获得B7-2基因，与pMD-18T连接作全自动测序，并利用基因重组技术构建包含B7-2的表达质粒pcDNA3.1-CMV-B7-2及pcDNA3.1-Egr-B7-2。结果：经测序证实获得的B7-2基因与文献报道的基本一致，并成功构建了表达质粒。结论：成功克隆了B7-2的编码基因，并成功构建了表达载体pcDNA3.1-CMV-B7-2及pcDNA3.1-Egr-B7-2。[关键词]共刺激分子B7-2/免疫学；逆转录多聚酶链反应；pcDNA3.1-B7-2表达载体[中图分类号]Q782;Q785[文献标识码]A研究表明,T细胞功能激活是肿瘤免疫基因治疗的关键,而T细胞激活至少需要两种信号：一是T细胞表面的特异性抗原识别受体与抗原提呈细胞上的MHC复合物结合的抗原多肽的相互作用；另一种是抗原提呈细胞上的共刺激分子与T细胞上相应的共刺激分子受体的结合，缺乏共刺激信号，体内的T细胞将不能对肿瘤抗原产生有效的应答而导致免疫耐受[1]。B7-1（又名为CD80）和B7-2（又名为CD86），是两个功能相似的最重要的共刺激分子。除B细胞来源的肿瘤外，其它肿瘤很少表达B7，共刺激分子B7的缺乏是肿瘤的弱免疫原性的重要因素。把B7基因导入肿瘤细胞的共刺激分子基因治疗，已成为近年来研究的热点[2,3,4]。本实验从小鼠脾细胞克隆了B7-2基因，并分别把它重组到带有CMV及Egr启动子的pcDNA3.1质粒上，构建成两种真核表达载体，为探讨新的肿瘤基因治疗方案奠定实验基础。1材料与方法1.1材料与试剂昆明系小白鼠，雌性，18g，健康。表达载体pcDNA3.1购自Invitrogen公司，大肠埃希菌DH5α由本室保存。Trizol试剂为Gibco公司产品，全自动测序由TaKaRa公司完成。内切酶、T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶、RT-PCRKit均为TaKaRa产品，其它生化试剂均为国产分析纯。1.2小鼠脾细胞的制备与总RNA的提取取健康18g昆明小鼠脾脏，于RPMI1640培养液（无FBS）中用毛玻璃研磨冲洗2次，取2X106脾细胞，用Trizol试剂按试剂盒说明书提取小鼠脾细胞总RNA。1.3RT-PCR法扩增有义链引物：5’-AGAACTTACGGAAGCACCCACG-3’,反义链引物：5’-GCTCTCACTGCCTTCACTCTGC-3’。参照TaKaRaone-stepRNAPCRkit试剂盒说明书，以2µg总RNA为模板进行RT—PCR，循环参数为：50℃15min,94℃2min,(94℃2min,60℃30s,72℃1min)25个循环，72℃10min。1.4RT-PCR产物测序以1%的琼脂糖凝胶电泳，回收930bp大小的基因片段，与pMD18T连接，以ABI公司的自动测序仪对克隆片段进行双向测序分析。[基金项目]本课题受国家自然科学基金资助（项目号）[作者简介]杨建征（1967--），男，吉林省长春市人，在读医学博士，主要从事肿瘤基因放射治疗研究。*通讯作者刘树铮：长春。吉林大学公共卫生学院放射生物教研室。（E-mailaddress:drliusz@yahoo.com）2结果2.1PCR产物的电泳结果见图1。321Fig.1IdentificationofRT-PCRProduct1.DL2000Marker(upwarddirection):2000,1000,750,500,250,100bp;2.RT-PCRproduct(930bp);3.DigestedbyEcoRV2.2pMD18T-B7-2测序测序结果与Genebank中收录的序列基本一致(有两个碱基不同，但不影响氨基酸编码)，证实本实验成功克隆获得了小鼠B7-2基因的cDNA序列（见图2）。Fig.2SequenceanalysisofmouseB7-2cDNA(The25thand576thbaseoftheRT-PCRproducingsequenceare“C”and“G”respectively,differentfromthose(“T”and“A”)ofmouseB7-2cDNAgiveninGeneBank,butthe“C”and“T”takesamerolesinencodingaminoacidLeu,aswellasthe“G”and“A”encodingaminoacidThr.)2.3真核表达质粒pcDNA3.1-CMV-B7-2及pcDNA3.1-Egr-B7-2的构建见图3。Fig.3ConstructionofpcDNA3.1-CMV-B7-2andpcDNA3.1-Egr-B7-22.4质粒的酶切鉴定见4、图5。4321Fig.4IdentificationofpcDNA3.1-CMV-B7-21.DL2000Marker(upwarddirection):2000,1000,750,500,250,100bp;2.pcDNA3.1-CMV-B7-2;3.DigestedbyBamhIandEcoRV;4.DigestedbyApaIandKpnI4321Fig.5Identificati...