优化农杆菌介导基因转化效率因子分析刘彩萍,曾炳山,裘珍飞,李湘阳,刘英(中国林业科学研究院热带林业研究所繁育中心,广东广州510520摘要共培养法是农杆菌介导转基因比较常用的方法之一。建立一个高效的遗传转化体系,除了确定抗生素种类,菌种和菌液浓度,预培养和共培养时间等基本因子外,优化影响转化的因子非常重要。主要介绍和分析共培养法中可能优化的影响基因转化因子,为提高农杆菌介导转化率提供了方法和依据。关键词农杆菌;预培养;侵染液;接种;共培养中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611(201003-01141-03AnalysisoftheOptimizedFactorsontheEfficiencyofAgrobacteriumMtedLIUCai2pingetal(BreedingCenterofTropicalForestryInstitute,AbstractCo2cultureisoneoftheAgrobacteriummediated.choiceofantibiotics,Agrobacteri2umstrainandopticaldensity,timeofthepre2co2mtransformationarealsoveryimportantindevelopinganefficientgeneticTheopoducedinco2culturemethodinordertoprovidemethodsandbasisforormation.Keywords;I2fluid;Inoculation;Co2culture“基金项目国家林业局948”引进国际先进农业科学技术项目(200624270。作者简介刘彩萍(1980-,女,山西宁武人,在读硕士,助理工程师,从事桉树转基因育种研究。收稿日期2009209223农杆菌(Agrobacterium是一种革兰阴性土壤杆菌,具有天然的基因转移能力。它可以侵染植物的受伤部位,将一段编码激素合成酶的DNA片段转移到被侵染的植物细胞基因组中,激素的过量生产导致被侵染的植物细胞自主生长,所以被科学家改良作为植物转基因的工具。用于植物基因转移的农杆菌有两种类型,即含有Ti质粒的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens和含有Ri质粒的发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes。在目前的应用中,主要以根癌农杆菌介导法为主[1-2]。与其他转基因方法相比,农杆菌介导法具有转化率高、导入植物细胞的片段确切,且导入的片段拷贝数低、表达效果好,使用的技术和仪器简单,是转基因方法中最普及、经济和有效的方法[1]。利用农杆菌介导进行林木基因转化的方法有叶圆片法、共培养法和直接接种法,其中共培养法利用比较普遍[3]。建立一个遗传转化体系,在确定了基本的技术参数指标后,需要逐步优化影响因子,从而提高转化效率。用农杆菌介导的共培养法来建立遗传转化体系时,一些基本的因子包括抗生素的确定、菌种的选择、菌液浓度、预培养时间、泡菌时间和共培养时间等,通过优化其中的一些影响因素,可以有效提高转化率,起到事半功倍的效果。笔者主要介绍和分析共培养法中可能优化的基因转化因子,为提高农杆菌介导转化率提供方法和依据。1预培养培养基的优化外植体进行共培养前,一般都要在含有外源激素的培养基上预培养一段时间,目的是使植物组织代谢活跃,促进细胞分裂,分裂状态的细胞更易整合外源DNA,从而提高外源基因的瞬时表达和转化率[4-5]。预培养的培养基一般是固定的,即为适合外植体再生的培养基,但是也有人认为,在预培养时降低钙的含量会促进农杆菌的侵染。钙在对致病微生物抵抗方面起到重要作用,而钙的不足会引起细胞壁结构的改变,这种改变使农杆菌更容易附在愈伤上,增强农杆菌对愈伤的感染能力。苏文潘等[6]在农杆菌介导橡树遗传研究中发现,外源钙的修饰改变了橡胶树胚胎组织结构,随着外源钙的增加,多糖化合物增多,刺激了细胞的分离。Mon2toro等[7]发现,橡胶树愈伤组织在无CaCl2培养基上预培养一段时间后,可以提高报告基因的瞬时表达活性,从而提高转化效率。Montoro等[8]在进行外源钙对农杆菌介导的橡胶树转基因影响的试验中发现,在无CaCl2培养基上继代培养2个星期的愈伤组织,内源钙降低了91%,细胞接受外源基因的活性增加。另外,培养基中其他成分如激素、有机营养物质等,都能使细胞处于活化状态,更容易接受外源基因。例如,NAA与62BA的使用可以明显提高水稻的转化效率,而ABA则明显降低转化率[9]。2侵染液制备方法的优化侵染液的制备是农杆菌转化的关键之一,侵染液中农杆菌的活力直接关系到共培养中农杆菌的侵染能力。农杆菌液体培养方法通常有两种:一种是先通过小管培养,得到一定体积的农杆菌菌液后,转入三角瓶中继续培养到一定的...