端粒酶抑制剂作用人鼻咽癌细胞株CNE2后蛋白表达谱的变容敏华(广西医科大学肿瘤医学院广西南宁530021)【摘要】目的分析不同作用机制端粒酶抑制剂分别作用于CNE2鼻咽癌细胞株后蛋白表达谱的变化。方法用EGCG等八种不同的端粒酶抑制剂分别作用于CNE2细胞，提取药物作用后细胞的总蛋白，运用基层辅助激光解析时间飞行质谱技术检测蛋內的变化，筛选共同差异蛋內。结果CNE2细胞经八种端粒酶抑制剂作用后，分别有14,26，27,23，31，42,26,30个蛋0低表达；分别有22,11,18，18,7,7,13,8个蛋白质高表达；均呈低表达的差异蛋白1个，相对分子量为2657.14Da,无共同高表达的差异蛋白。结论八种端粒酶抑制剂作用后，CNE2细胞表现出共性变化的蛋0。这些蛋白可能参与端粒酶活性的调控，可能是不同机制端粒酶抑制剂作用的共同靶点。【关键词】端粒酶端粒酶抑制剂鼻咽癌细胞SELID-TOF-MS【屮图分类号】R73-3【文献标识码】A【】2095-1752(2012)12-0394-02端粒酶(telomerase)是由RNA和蛋白质构成的一种特殊的DNA聚合酶，具有逆转泶酶活性。已证实端粒酶在肿瘤发生、发展过程屮起着重要的作用，端粒酶已成为当今肿瘤新的标志物和肿瘤治疗的新靶点［1］。近年不同学者致力于开发不同作用机制的端粒酶抑制剂，不同作用机理的抑制剂在不同类型细胞的生物分子靶点不一，端粒酶活性可能存在某些调控机制，不同端粒酶抑制剂可能在这些调控通路上的不同环节起丫作用［2,3］。但目前端粒酶的关键调控机制尚不清晰［4］。表面増强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术是蛋白质组学屮一种很重要的新质谱技术，通过它可对比同一组织在不同生理状态K的蛋白质组谱图，发现该组织蛋白质组屮各蛋白质表达量的变化。本研究以人鼻咽癌CNE2细胞为研究对象，将EGCG、A主题、ATRA、ADM、针对人端粒酶RNA(hTR)及其催化亚基(hTERT)的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸八种不同作用机制的端粒酶抑制---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---剂分别作用于CNE2细胞，运用SELDI技术分析癌细胞前后表达的差异蛋白以及共性蛋白，从而探讨端粒酶活性的关键调控因素和可能作用机理。1材料与方法1.1细胞株：CNE2细胞株从中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心购买。在5%CO2,37°C条件下，培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，常规换液及传代。1.2端粒酶抑制剂：针对hTR的核什酸序列ASODN5CTCAGTTAGGGTTAGACAA3，SODN：5CTAACCCTAAC3；针对hTERT的核苻酸序歹|J:HASODN5GGAGCGCGCGGCATCGCGGG3，HSODN5CCCGCGATGCCGCGCGCTCC3，EGCG(Epigallocatechingallate)、A主题、ATRA、ADM,均购自Sigma公司；1.3ProteinChipreg;BiologySystem(PBSIIC)及其配套的CM-10芯片，美国CiphergrnBiosystems公司；1.4端粒酶抑制剂作用细胞：CNE2细胞状态良好且长满培养瓶底面积约60%时分别力门入ADM、A主题、ASODN、ATRA、EGCG、HASODN>HSODN和SODN8种端粒酶抑制剂，终浓度分别为lmg/L，20mu;mol/L,6mu;mol/L,10mu;mol/L,125mg/L,5mu;mol/L,5mu;mol/L,6mu;mol/L。48h后收集加药后细胞作为加药处理组，以及同代培养未加药物CNE2细胞作为对照组。1.5裂解细胞：倒弃培养液，用火菌的PBS(PH=7.4)5ml轻轻洗涤培养瓶底3次。加入预冷的细胞裂解液2〜3ml，置摇床，200rpm冰上振荡裂解30〜60min。将裂解后液体在4°C,12000rpm，离心5min后吸取上清液至3000Da的超滤离心管，12000rpm,4°C,离心30〜60min,浓缩体积至200〜300mu;l。Brandford法测浓缩后裂解液蛋白浓度。1.6蛋白芯片裂解液样品的准备：分别取10mu;l样品裂解液至1.5mlEP管，按样品蛋白总质量：U9缓冲液体积为40:1的比例分别加入U9缓冲液稀释；冰浴振荡30min(400〜600rpm);将适量WCX-2buffer加入上述变性后样品，使样品终浓度为1.0mu;g/mu;l,尽快混匀。---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---1.7芯片检测：芯片每孔加入2MNaCI200mu;l,室温下120rpm振20min,倒弃NaCI;加入去离子水200mu;l，室温下120rpm振荡5min，倒掉去离子水，重复3次;加入Hepes200mu;l，立即甩出；加入NaAc缓冲液200mu;l,振荡5min,倒掉缓冲液，重复1...