反义端粒酶RNA对人胃癌细胞端粒长度及端粒酶活性调控的研究

反义端粒酶RNA对人胃癌细胞端粒长度及端粒酶活性调控的研究摘要:目的探讨反义端粒酶RNA(hTR)对人胃癌细胞端粒长度(TRF)及端粒酶活性的调控作用。方法应用反义hTR真核表达载体经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901,通过分子杂交及端粒重复扩增PCR方法检测hTR表达及端粒、端粒酶活性变化。结果经HYR筛选,转染细胞形成稳定克隆,反义hTR表达增强、正义hTR表达下调,平均TRF缩短、端粒酶活性受抑。结论反义hTR对胃癌细胞TRF及端粒酶活性的调控可能是通过其对hTR模板的“封闭”而发挥作用的,反义hTR可以作为胃癌基因治疗的一种新靶点。关键词:端粒酶;端粒;反义RNA;胃肿瘤中分类号:R73-36文献标识码:A文章编号:1000-8578(2000)04-03AntisenseHumanTelomeraseRNAMediatedInhibitionofTelomereandTelomeraseActivityinHumanGastricCancerCellsZHANGFan-xin,ZHANGXue-yong,FANDai-ming,etal(GeneralHospitalOfLanzhouCommand,Lanzhou730050,China)Abstract:ObjectivcToobserveeffectsofantisensehumantelomeraseRNA(hTR)ontelomericlength(TRF)andtelomereaseactivityofhumangastriccancercellSGC7901.MethodsSGC7901celllinewastransfectedwithantisensehTRexpressionvector(pBBS-hTR)bylipofectamine,andexpressionsofhTR,telomereandtelomeraseactivityinthegenetransfectedcellsweredetectedbyhybridizationofnucleicacidsandatelomericrepeatamplificationprotocol(TRAP).ResultsClonescontainingantisenseorcontrolplasmidswereselected3weeksaftertransfectionbyHyRselectionandeitherantisensehTRexpressionhadbeenenhancedorsensehTRexpressionhadbeeninhibited72haftertransfectionbyspecificstainedRNAprobe.TelomeraseactivityandmeanTRFlengthweregenerallowinthegenetransfectedcellsincomparisionwiththoseinthecontrolplasmidtransfectedcells.ConclusionAntisensehTRmayeithercontrolTRFlengthbyblockingthetemplateregionofhTRorserveasaeffectivetargetfortreatinggastriccancerbyinhibitingtelomerase.Keywords:Telomerase;Telomere;AntisenseRNA;Stomachneoplasms端粒作为构成染色体不可缺少的重要要素,对维持细胞染色体的完整性和增殖力具有重要的作用[1]。在正常人体细胞,端粒DNA序列随着细胞分裂逐渐缩短直至染色体末端DNA不能复制而引起细胞衰亡,相反,永生化细胞或癌细胞,端粒DNA并不随细胞分裂呈净丢失。提示端粒长度(telomererestrictionfragments,TRF)的维持是细胞永生化及恶性转化的重要分子基础。而调控TRF长度的关键分子则是最近发现的端粒酶[2]。端粒酶作为一种特殊的反转录酶,它具有拷贝端粒DNA的模板,能够不断地合成端粒序列添加到染色体末端,使细胞获得永生化并达到足以损害机体的程度。这已得到端粒酶几乎在所有人体恶性肿瘤呈阳性表达,而在正常组织不表达或弱表达研究结果的有力支持[3]。表明端粒酶的活化是调控TRF的重要条件。因此,端粒酶有可能成为癌症基因治疗的新靶点。为探索端粒酶在胃癌靶向治疗中的可能性,本文应用反义端粒酶RNA真核表达载体转染人胃癌细胞,观察其对胃癌细胞TRF及端粒酶活性的调控作用。1材料与方法1.1反义端粒酶RNA真核表达载体(pBBS212-hTR)构建见文献[4],及人端粒酶RNA重组质粒(pGRN83)均由美国GeronCorporation,Villeponteall博士惠赠。人胃癌细胞株SGC7901由第四军医大学消化病研究所提供,DNAMarkers、DNA纯化Kit、T4噬菌体多核苷酸激酶、限制性内切酶、SP6及T7RNA聚合酶Kit为Promega公司产品,LipofectAMINE、RPMI-1640、TagDNA聚合酶为GIBCO公司产品。潮霉素(HYR)、T4g32蛋白为BoehringerMannheim公司产品。TS、CX引物及(TTAGGG)4寡核苷酸由上海生工公司合成。[α-32p]dCTP、[ν-32p]ATP及[α-32p]UTP由北京亚辉公司提供。1.2主要方法1.2.1质粒pBBS-hTR的扩增、提取、纯化及鉴定[5]。1.2.2pBBS-hTR表达载体经脂质体介导转染SGC7901细胞,按试剂说明操作。配A液含100ul无血清RPMI1640及5ug质粒DNA,配B液含90ul无血清RPMI1640及10ul脂质体,将两液混匀,放置15min,再加0.8ml无血...

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