本文档下载自文库下载网，内容可能不完整，您可以点击以下网址继续阅读或下载：http://www.wenkuxiazai.com/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法非常好的一种方法。安徽农业科学,JournalofAnhuiAgr.iSc.i2010,38(2):600-601,619责任编辑??李菲菲??责任校对??傅真治一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法李惠敏,胡雪英,秦新民*??(广西师范大学生命科学学院,广西桂林541004)摘要??[目的]对土壤微生物的DNA进行提取,以建立一种适用于PCR技术分析的土壤微生物DNA的快速提取方法。[方法]采用了2种不同的直接裂解法提取土壤微生物DNA,并用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增16SrDNA片段。[结果]2种方法提取的土2壤微生物总DNA电泳结果显示没有差别,但是只有CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取的总DNA不需要纯化,在增加Mg用量的条件下,只需用第一轮非特异PCR产物作为模板即可扩增出16SrDNA片段。[结论]CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取土壤DNA,方法操作简单、快捷,同时适用于PCR分析,为土壤微生物群落结构的多样性分析奠定了基础。关键词??土壤微生物DNA;提取;PCR;16SrDNA中图分类号??S154.34????文献标识码??A????文章编号??0517-6611(2010)02-00600-02AnExtractionMethodofSoilMicrobialDNAforPCRAnalysisLIHui??minetal??(CollegeofLifeScience,GuangxiNormalUniversity,Guilin,Guangxi541004)Abstract??[Objective]TheamiofthisstudywastoextractDNAfromsoilmicroorganismsandestablishtherapidextractionmethodofsoilmi??crobialDNAforPCRanalysis.[Method]Twokindsofdifferentdirectpyrolysismethodswereinvestigated.16SrDNAwasamplifiedwithbacterialuniverhttp://www.wenkuxiazai.com/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.htmlsalprmiers27Fand1492RbyPCR.[Result]TheelectrophoresisresultsoftotalDNAfromsoilmicroorganismsbytwokindsofDNAex??tractionmethodshadnodifference.WithoutpurificationofTotalDNAextractedbyCTAB,lysozyme,freezingthawpyrolysismethod,thefirst??cycle2non??specificPCRproductscouldbeusedasthetemplatetoamplify16SrDNAfragmentsundertheconditionsofaddingMgamoun.t[Conclu??sion]SoilDNAcouldextractedbyCTAB,lysozyme,freezingthawpyrolysismethod.Themethodwassmipleandfastinoperation,suitableforPCRanalysis.Theresearchprovidedthebasisforthediversityanalysisofsoilmicrobialcommunities.Keywords??SoilmicrobialDNA;Extraction;PCR;16SrDNA????土壤是微生物栖居的主要场所,微生物在土壤中的分布及生命活动与土壤肥力、植物营养、植物病害和植被状况等密切相关。因此,研究土壤微生物群落和多样性对有机物的形成和分解、土壤监测与生态环境改善等方面有着重要的意义。现在广泛公认在环境样品中只有0.001%~15.000%的微生物具有可培养性,其中土壤约为0.300%,活性污泥约为[1]1.000%~15.000%。因此,利用传统微生物学分离纯化培养的方法来检测环境样品中的微生物会极大地低估样品中微生物的多样性。随着分子生物学的理论与技术在微生物生态学研究中的不断渗透,微生物多http://www.wenkuxiazai.com/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html样性的研究有了新的突破。而以16SrRNA序列分析作为微生物分类系统的主要依据也得到了广泛认同。由于土壤的理化成分复杂,在提取的过程中含有较多的抑制成分,如腐殖酸、酚类化合物、重金属离子等,其中又以腐殖酸和腐殖酸类似物的抑制作用最明显,它们主要通过干扰裂解、使核酸降解或非特异性吸附和抑制酶活性的方式起作用。总之,从土壤环境中高效地获得微生物基因组DNA具有相当的难度,所提取DNA的质量将在很大程度上影响后续的PCR、酶切等的研究工作[3-4][2]1.1.2??试剂与仪器。TENP缓冲液(pH值8.0):50mmol/LTris,20mmol/LEDTA,100mmol/LNaC,l1%(W/V)PVP。DNA提取液(pH值8.0):100mmol/LTris,100mmol/LED??TA,200mmol/LNaC,l2%(W/V)PVP,2%(W/V)CTAB。DNA提取液!(pH值8.0):100mmol/LTris,100mmol/LED??TA,100mmol/L磷酸钠,1.5mol/LNaC,l1%CTAB,2?Cl2,1??g/mlBSA。SigmaK??38高速冷冻离心...