临床医学临床检验诊断学专业毕业论文[精品论文]HMGB1与LPS协同刺激巨噬细胞产生致炎细胞因子的机制研究关键词：高迁移率族蛋白1致炎细胞因子内毒素巨噬细胞摘要：高迁移率族蛋白1(highmobilitygroupboxprotein1，HMGB1)是高迁移率族蛋白中的一种，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率快而得名。HMGB1的基因同源性很高，人和鼠的同源性在99％以上。最初发现HMGB1是一种非组蛋白核蛋白，在核内能够识别和结合DNA，参与DNA的转录、复制、修复以及细胞运动等。后续的研究认为，HMGB1是一种具有双功能的警报素(alarmin)，在细胞外具有细胞因子功能，可以启动天然和获得性免疫过程，并参与了败血症、感染和自身免疫等急慢性炎症过程。关于HMGBl的胞外活性不同时期、实验室得出不同的结论，由于大多数实验中使用的HMGB1大部分为原核表达系统表达的重组蛋白，在蛋白分离、纯化过程中可能残留各种原核细菌的组分，造成HMGB1胞外活性的不同，而其中最容易含有的就是内毒素。尽管大多数实验中使用的HMGB1重组蛋白经过除内毒素处理，但内毒素检测一般还残留约4EU/μg左右；如此低浓度的内毒素一般不能激活巨噬细胞产生大量细胞因子，因而被认为主要是HMGB1蛋白的直接作用。大量文献报道表明HMGB1激活巨噬细胞等免疫活性细胞是HMGB1参与像内毒素血症、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等疾病炎症反应的主要方式。上世纪90年代初，就有研究发现在约40％青少年RA患者血清中可以检测出抗HMGB1或2的抗体，到2002年研究发现在RA患者的血清和关节液内有异常增高的HMGB1，并在实验性RA大鼠模型中得到证实。2003年PulleritsR等在小鼠关节内注入重组HMGB1蛋白成功诱发小鼠关节炎模型，而对IL-1基因敲除的小鼠没有作用，研究发现HMGB1通过激活靶细胞NF-κB促使其分泌大量的IL-1β在小鼠关节炎的发病中起重要作用。后续的研究发现系统性给予可溶性RAGE可以显著降低HMGB1诱发的关节炎，从而证实了HMGB1可能通过RAGE激活靶细胞诱发实验性关节炎。给予HMGB1中和抗体或可以抑制HMGB1功能的ABox肽都可以显著降低病损部位的IL-1β表达和关节软骨损伤，减轻胶原诱导的实验性关节炎，证实HMGB1可能成为RA治疗新的靶位。一些研究表明有些抗风湿药就可能是通过抑制HMGB1的释放发挥治疗作用的，如硫代苹果酸金钠。金制剂属于慢作用抗风湿药物，研究发现硫代苹果酸金钠剂量依赖地抑制LPS刺激巨噬细胞引起的HMGB1分泌，可能是金制剂治疗RA的一个分子基础。为了进一步阐明HMGB1在RA疾病发生中的作用及其作用的主要细胞信号通路，以及阻断HMGB1或下游关键分子治疗RA的可行性，我们首先设计体外实验研究HMGBl激活巨噬细胞的分子机制，却意外发现不同批次的重组HMGB1激活巨噬细胞分泌致炎细胞因子的能力差异巨大，为了探讨：HMGB1胞外活性差异的本质以及HMGB1激活巨噬细胞的分子机制，本研究通过体外和体内实验探讨HMGB1撤活巨噬细胞的实质和通路来阐明HMGB1参与炎症免疫反应的方式，加深我们对于HMGB1本质的认识和为疾病的治疗提供理论支持。本研究分为三个部分：第一部分：考虑到HMGB1胞外活性差异较大，并且由于大多数实验中使用的HMGB1是原核表达系统表达的重组蛋白，在蛋白分离、纯化过程中可能残留各种原核细菌的组分，造成HMGB1胞外活性的不同，而其中最不容易清除的就是内毒素。我们利用小鼠腹腔巨噬细胞作为工具细胞，检测不同来源HMGB1激活巨噬细胞分泌致炎细胞因子的活性，结果发现不同批次HMGB1蛋白激活巨噬细胞分泌致炎细胞因子的活性差异很大，并且同其含有的内毒素含量正相关。不含内毒素的HMGB1体外几乎没有致炎活性，单独不能激活巨噬细胞分泌致炎细胞因子；而内毒素含量超过3000EU/mg(Lot077K4002)的HMGBl蛋白则可以激活巨噬细胞分泌大量的TNF-α，Real-timeRT-PCR检测也显示致炎细胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等mRNA表达显著上调。提示HMGB1本身胞外致炎活性很弱，激活巨噬细胞分泌致炎细胞因子的能力依赖于其结合的内毒素。第二部分：尽管第一部分的实验结果显示Lot077K4002的HMGB1蛋白内毒素含量超过3000EU/mg(小于6000EU/mg)，但不能完全解释巨噬细胞分泌的大量TNF-α，因为1μg/mlLot077K4002的HMGB1含有...