药理学专业毕业论文[精品论文]CaN信号通路调控白念珠菌基因RTA2的表达机制及功能研究关键词：白念珠菌钙调神经磷酸酶RTA2基因转录调控机制CaN通路转录因子摘要：白念珠菌耐药是抗真菌治疗失败的主要原因，白念珠菌钙调神经磷酸酶(CAN)通路与耐药性产生密切相关，我们的前期研究发现RTA2基因是CaN通路调节白念珠菌对唑类药物的耐药性产生的必需基因，但RTA2的转录调控机制目前尚不清楚。本课题首先利用基因敲除方法构建RTA2基因在白念珠菌CNA(CaN催化亚单位编码基因)缺失菌DSY2101(()/()cna)和CRZ1(CaN通路转录因子Crzlp编码基因)缺失菌DSY2195(()/()crzl)中的缺失菌DJY201(()/()cna()/()rta2)、MJY201(()/()crzl()/()rta2)。然后利用微量液基稀释法考察了在白念珠菌CAF2-1(野生菌)、DSY2091(()/()cna)、DJY201(()/()cna()/()rta2)、DSY2115(CNA回复菌)、DSY2195(()/()crzl)、MJY201(()/()crzl()/()rta2)和MKY268(CRZ1回复菌)中，加入细胞外钙离子对氟康唑的抗真菌活性的影响。结果发现：在白念珠野生型菌CAF2-1中，加入2.5mmol/LCaCl2能够显著降低氟康唑的抗真菌活性(MIC80从0.5μg/ml增加到64μg/ml)；在DSY2091、DJY201、DSY2195和MJY201中，加入2.5mmol/LCaCl2对氟康唑的抗真菌活性几乎没有影响；在CNA回复菌DSY2115和CRZ1回复菌MKY268中，加入2.5mmol/LCaCl2又能够显著降低氟康唑的抗真菌活性(MIC80从0.5μg/ml增加到16μg/ml和64μg/ml)，证明RTA2基因是CaN通路调节白念珠菌对唑类药物的耐药性产生的靶基因。本课题又利用报告基因法研究RTA2基因的转录调控机制。首先设计引物，利用Pyrobest高保真酶PCR扩增报告基因RLUC，并与白念珠菌ACT1基因的终止片段融合，克隆到质粒pBES116，得到载体pBES-RLUC-ACT1，然后再利用Pyrobest高保真酶PCR扩增RTA2起始密码子上游973bp、785bp、455bp、440bp和274bp序列，分别克隆到载体pBES-RLUC-ACT1，得到的报告基因载体分别命名为pBES-R1、2、3、4、5，分别转化CRZ1缺失菌和RTA2缺失菌后，利用CaCl2激活CaN信号转导通路，提取蛋白，加入RLUC的底物coelentrazine，测定RLUC的活性，结果发现：CRZl缺失菌转入质粒pBES-RTA1，2-5转化子的报告基因RLUC的活性低，证明RTA2基因是CaN通路转录因子Crzlp调控的靶基因，进一步筛选得到CaN信号转导通路调控RTA2基因的调控元件位于RTA2起始密码子上游455bp到785bp的区域内。综上所述，本课题研究证明RTA2基因是CaN通路转录因子Crzlp调控的靶基因，筛选确定RTA2基因表达的调控元件位于起始密码子上游455bp到785bp的区域内。---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---正文内容白念珠菌耐药是抗真菌治疗失败的主要原因，白念珠菌钙调神经磷酸酶(CAN)通路与耐药性产生密切相关，我们的前期研究发现RTA2基因是CaN通路调节白念珠菌对唑类药物的耐药性产生的必需基因，但RTA2的转录调控机制目前尚不清楚。本课题首先利用基因敲除方法构建RTA2基因在白念珠菌CNA(CaN催化亚单位编码基因)缺失菌DSY2101(()/()cna)和CRZ1(CaN通路转录因子Crzlp编码基因)缺失菌DSY2195(()/()crzl)中的缺失菌DJY201(()/()cna()/()rta2)、MJY201(()/()crzl()/()rta2)。然后利用微量液基稀释法考察了在白念珠菌CAF2-1(野生菌)、DSY2091(()/()cna)、DJY201(()/()cna()/()rta2)、DSY2115(CNA回复菌)、DSY2195(()/()crzl)、MJY201(()/()crzl()/()rta2)和MKY268(CRZ1回复菌)中，加入细胞外钙离子对氟康唑的抗真菌活性的影响。结果发现：在白念珠野生型菌CAF2-1中，加入2.5mmol/LCaCl2能够显著降低氟康唑的抗真菌活性(MIC80从0.5μg/ml增加到64μg/ml)；在DSY2091、DJY201、DSY2195和MJY201中，加入2.5mmol/LCaCl2对氟康唑的抗真菌活性几乎没有影响；在CNA回复菌DSY2115和CRZ1回复菌MKY268中，加入2.5mmol/LCaCl2又能够显著降低氟康唑的抗真菌活性(MIC80从0.5μg/ml增加到16μg/ml和64μg/ml)，证明RTA2基因是CaN通路调节白念珠菌对唑类药物的耐药性产生的靶基因。本课题又利用报告基因法研究RTA2基因的转录调控机制。首先设计引物，利用Pyrobest高保真酶PCR扩增报告基因RLUC，并与白念珠菌ACT1基...