：1674-7054（2010）02-0000-00高蛋白酶活性的地衣芽孢杆菌热带菌种的筛选与鉴定陈圣丰1，林钦2，周永灿1，欧阳吉隆1，王世锋1，谢珍玉1（1.海南大学海洋学院，海南省热带水生生物技术重点实验室，海南海口570228；2.中国水产科学院南海水产研究所，广东广州510300；）摘要：从海南省文昌市、海口市的海水养殖池和天然海域中采集的海水与底泥样品中中分离和筛选出13株具有高蛋白酶活性的地衣芽孢杆菌菌株，经菌落形态观察、标准生理生化分析和16SrDNA测序，确定所获得菌株均为野生型热带种地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）。关键词：地衣芽孢杆菌；高蛋白酶活性；热带种；筛选：Q93-331文献标志码：A地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）能产生高效的胞外蛋白酶[1]、脂肪酶[2]和淀粉酶[3]等生物活性物质。近年来，地衣芽孢杆菌作为一种生态制剂广泛应用于水产养殖业中，它和其他种类的芽孢杆菌、光合细菌等有益微生物共同作用，可有效改善养殖水质，促进水产养殖生物的生长和发育[4,5]。地衣芽孢杆菌为多种污水和有机物无害化处理的常用菌种，也是重要的蛋白改性和助消化的有益微生物，受到国内学者的广泛关注。如杜珍辉等将地衣芽孢杆菌工业菌株应用于猪粪液的无害化处理[9]；李红梅等研究了丹麦的地衣芽孢杆菌菌株的碱性蛋白酶对玉米蛋白改性的作用[10]；刘波等人研究了美国的地衣芽孢杆菌菌株对鱼类消化功能的影响[11]；谢航等人研究了从福建土壤中分离的地衣芽孢杆菌对养殖水体中残余饵料的降解特性[12]。但国内学者的研究均未涉及地衣芽孢杆菌的热带地理种群的应用研究。笔者采用脱脂牛奶平板法，从海南省文昌市、海口市的水产养殖池和天然海域中采集的海水与底泥样品中分离和筛选出具有高蛋白酶活性的菌株，并用表型鉴定和16SrDNA序列分析等方法对所分离的菌株进行鉴定，为热带海水养殖的水质净化提供高效的土著菌种参考菌株。1材料与方法1.1材料1.1.1样品用于分离筛选芽孢杆菌的样品为笔者于2008年12月和2009年5月从海南省文昌市、海口收稿日期:2010-04-08资助项目：农业科技成果转化项目（2009GB2E200302）；科技人员服务企业项目（2009GJE20024）；海南省重点科技项目（090501）；农业部渔业生态环境重点开放实验室和广东省渔业生态环境重点实验室开放基金（2007-10）.作者简介：陈圣丰(1983–)，男，海南万宁人，海南大学海洋学院水产养殖专业2007级硕士研究生.通信作者：谢珍玉(1974–)，男，江西吉安人，海南大学海洋学院博士、副教授.E-mail:xiezyscuta@163市的水产养殖池和天然海域中采集的海水和底泥样品。对照菌株为目前海南水产养殖中2种常见的有益微生物制剂所分离的菌株。1.1.2培养基芽孢杆菌选择性培养基配比：胰蛋白胨5g.L-1、酵母浸膏2.5g.L-1、葡萄糖1g.L-1、琼脂13g.L-1、NaCl70g.L-1、pH7.5。普通海水液体培养基配比：酵母浸膏1g.L-1、牛肉膏3g.L-1、蛋白胨5g.L-1、NaCl30g.L-1，pH7.5。普通海水固体培养基配比：在普通海水液体培养基基础上加入琼脂13g.L-1，pH7.5。1.1.3试剂固定液：ψ=10%的三氯乙酸。染色液：乙醇45mL、冰乙酸10mL、考马斯亮兰G-2500.25g、蒸馏水45mL。脱色液：乙醇50mL、冰乙酸75mL、蒸馏水875mL。1.2方法1.2.1菌种分离参考文献[6]方法制备芽孢杆菌选择性培养基。海水样品经摇匀后，取100μL均匀涂布于芽孢杆菌选择性培养基上，(50±1)℃培养24h，挑取表面粗糙、皱褶的乳白色单菌落为初筛的目标菌株。对底泥样品和市售的有益微生物制剂产品分别加适量灭菌海水充分均匀后进行分离，分离方法同上。1.2.2菌种保藏分别将初筛的326株目标单菌落接种于普通海水液体培养基，37℃培养24h，按1：1比例分别将菌液和ω=80%无菌甘油加入保种管，-80℃长期保存备用，每株4管。1.2.3高蛋白酶活性菌株的筛选目标菌株培养液的制备：用接种环挑取初筛的326株目标菌株，分别接种于普通海水液体培养基中，30℃180r·min-1振荡培养24h，6000r·min-1离心10min，收集上清液各10mL，并用0.20μm滤膜过滤除菌，获得目标菌株培养液，-20℃保存备用。脱脂奶平板法测定蛋白酶活：配制含ψ=5%无菌脱脂牛奶的灭菌海水琼脂平板，用直径4mm的打孔器在平板上...