促红细胞生成素对脑出血大鼠神经保护作用及机制探析［摘要］目的研究大鼠脑出血不同时期脑水肿、Fas相关死亡域蛋白(FADD)表达和细胞凋亡及红细胞生成素(EPO)对其的影响，探讨EPO对脑出血的神经保护作用和机制。方法SD雄性大鼠随机分为假手术组、出血组、EPO治疗组，采用自体血脑内注射法建立脑出血动物模型，应用免疫组化方法检测脑出血后不同时间点血肿周边脑组中FADD表达情况，TUNEL法检测凋亡细胞，用干湿比重法测定脑组织含水量。结果与模型组比较，EPO治疗组脑组织含水量明显降低，FADD表达减少，凋亡细胞减少。结论EPO可以减轻脑出血后的脑水肿；EPO通过抑制FADD表达，抑制脑出血后血肿周围神经细胞凋亡，减轻继发性损伤，起到神经保护作用。［关键词］促红细胞生成素；脑出血；脑水肿；FADD；细胞凋亡［中图分类号］R493；R743［文献标识码］A［文章编号］1673-9701(2013)03-0001-03脑出血(Inti'acerebralhemorrhage,ICH)后血肿本身及继发性水肿压迫直接损害脑组织外，血肿周围脑细胞继发性凋亡机制也参与ICH后脑损伤。相关实验证明促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)及相应受体(EP0R)在神经组织中均有表达[1-2]o动物实验及临床研究均发现EPO具有神经营养和神经保护作用。Fas相关死亡域蛋白(Fas-associatedwithdeathdomainprotein,FADD)是死亡受体介导凋亡途径重要的启动子，在细胞凋亡中起到重要的作用[3]o本实验通过观察促红细胞生成素对脑血肿周围细胞FADD表达与细胞凋亡的影响，以及血肿周围脑组织水肿影响，探讨促红细胞生成素的神经保护作用及相关机制。1材料与方法1.1实验材料健康雄性SD大鼠126只，体重(250±30)g；河北联合大学实验动物中心提供，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。兔抗鼠FADD多克隆抗体、二抗试剂盒及TUNEL试剂盒、DAB显色试剂盒、采购于博士德生物工程有限公司；重组人促红细胞生成素(EPO)购自上海克隆生物高技术有限公司。1.2方法1.2.1脑出血模型制备雄性SD大鼠126只，随机分为脑出血组、脑出血EPO治疗组、假手术组。每组再根据时间先后分为术后3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d共七组，每组6只大鼠。EPO治疗组于术后立即腹腔注射EPO3000U/kg,此后每24小时腹腔注射同等剂量EPO,其余组氯醛(0.04mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，开胸暴露心脏及主在相应时间点注射等量的生理盐水。模型制备：术前48h大鼠头部预先脱毛，术前12h禁水及饲料，10%水合氯醛(0.035mL/kg)腹腔麻醉大鼠。根据汤继宏［4］等报道方法结合大鼠立体定位图谱，在立体定位仪上，从头部正中纵向切开皮肤，双氧水剥蚀骨膜，于前囱前0.2mm中线向右旁3mm处钻孔，同时用温水浸泡鼠尾，消毒后断尾取血，微量注射器抽血50UL孔中垂直进针6mm,均速旋转针芯推注，整个过程时间控制在3min内完成。推注血液后保留不动10min后退针；骨蜡封闭骨孔，缝皮。术后大鼠可自由活动、进食。假手术组有微量注射器进针过程，不注射血液。1.2.2脑组织标本制作根据实验设计的时间点用水合动脉，用磨钝12号针头从左心室插入直至主动脉，刀片划破右心房。用注射器将TTC生理盐水慢速注入体循环，约200mL后右心房流出的液体无色，换用4%多聚甲醛磷酸缓冲液250mL灌流5min直至大鼠尾巴及四肢僵硬。开颅取出血侧针孔前出血灶周围约100mg进行脑组织含水量测定，余大脑置于4%多聚甲醛后固定24h以上，取标本针孔后约2mm脑组织，制成切片备用。1.2.3FADD免疫组织化学染色方法①脑组织切片逐步梯度脱蜡至水。②置3%H202液体20min。③高温修复抗原。④封闭液30min,PBS洗涤，兔抗鼠FADD多克隆抗体37匸湿盒反应1h,PBS洗涤。⑤滴加二抗，371湿盒孵育1h,PBS洗涤。⑥过氧化物酶溶液371反应30min,滴加DAB剂覆盖组织，室温避光显色3〜5min至显色，水洗终止反应。⑦苏木素复染，水洗终止反应，充分蓝化30mino树胶封片。1.2.4细胞凋亡检测步骤①标本切片脱蜡至水；②置配制的3%H202溶液于室温20min；③标本片加0.01MTBS1：200新鲜稀释ProteinaseK37°C消化1〜15min；④TdT和DIG-d-UTP各1uL,加入18uL标记缓冲液中，滴在样品上置于湿盒中，37£标记2ho⑤加封闭液50UL/片，室温30min；⑥抗体稀释液1：100稀释生物素化抗地高辛抗体;⑦抗...