MS—275体外诱导膀胱癌细胞凋亡的机制探析［摘要］目的研究组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂MS-275对膀胱癌T24细胞的诱导凋亡作用，并初步探讨其分子机制。方法用MTT法检测MS-275对T24细胞的生长抑制作用，并观察其有效作用浓度，采用荧光显微镜及原位末端标记(TUNEL)法观察和检测MS-275对T24细胞的诱导凋亡作用，采用流式细胞仪(FCM)检测Bcl-2和Bax在细胞内表达的动态变化。结果MS-275抑制T24细胞的半抑制浓度(IC50)为(5.21±0.61)umol/Lo4.0umol/L的MS-275处理T24细胞后可观察到典型的凋亡形态学变化，且随着作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高，同时引起Bcl-2及Bax的表达率分别下调和上调。结论HDAC抑制剂具有体外诱导膀胱癌细胞凋亡的作用,其作用机制涉及Bcl-2及Bax表达的动态改变。［关键词］膀胱癌；组蛋白去乙酰化酶；细胞凋亡［中图分类号］R737.14［文献标识码］A［文章编号］1673-7210(2012)10(a)-0033-03膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，每年有350000例以上的新发病例，并且有145000人死于此病［1］。其生物学行为呈多样性，而容易复发是其重要生物学特性。目前对其发生、复发、浸润及转移的机制尚未完全明了，大部分膀胱癌在确诊时是表浅性的，经过局部手术治疗后复发率为50%〜70%,进展率为15%〜30%。现有的传统抗肿瘤药物治疗尚有一定的局限性，从新的角度寻求有效的抗肿瘤药物有望取得突破性进展。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeactylaseinhibitors,HDAC抑制剂)是一类通过抑制组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)而改变染色质结构，在转录水平进行基因表达调控的化合物，依其化学结构可分为六类，而MS-275是苯酰胺类HDAC抑制剂中最具活性的一种化合物，其显示出对一些血液系统肿瘤［2］和实体肿瘤［3］有较强的抗肿瘤活性。本实验将探讨MS-275对膀胱癌细胞的诱导凋亡作用及其机制。1材料与方法1.1细胞培养人膀胱癌T24细胞来源于中国科学院上海生物细胞研究所，实验时取对数生长期的细胞，在含10%小牛血清的细胞培养基(DMEM)培养液中培养，在37°C.5%C02、饱和湿度条件下生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。1.2MTT实验T24细胞以5X104/mL、100uL/孔,接种于96孔培养板，培养24h后，分别加入浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0nmol/L的MS-275作为5个实验组，阴性对照组不加MS-275,空白对照组为单纯DMEM培养液，每组各设5个复孔。继续培养48h,每孔加入5g/L的MTT溶液10uL,再培养4h,吸出孔内培养液，每孔加100uL二甲基亚枫(DMS0),酶标仪测定吸光度，选择492nm波长，用空白对照组调零，计算细胞生长抑制率(%)=(1-实验组吸光度/对照组吸光度)X100%o以细胞生长抑制率与药物浓度的对数作图，在图上求出MS-275对T24细胞的半抑制浓度(IC50)值。选取接近于IC50值的浓度用于下一步实验。1.3荧光显微镜观察凋亡的形态学变化将T24细胞以1X105/孔接种于6孔培养板，观察细胞贴壁且生长良好后，加入浓度为4.0umol/L的MS-275作为实验组，非药物处理组作为对照组，继续分别培养12、24、48h,细胞经胰蛋白酶消化收集后，以磷酸盐缓冲液(PBS)调整细胞密度为1X106/mL,制成单细胞悬液，取95uL细胞悬液，加人100ug/ml的吓噪橙染液5UL混匀，取10UL混合液于载玻片上，加盖玻片后于荧光显微镜(OlympusBX60)下(515nm激发光)观察细胞形态学变化并摄片。1.4原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡4umol/L的MS-275分别处理细胞12、24、48h,设阴性对照，每个时间点设3个复孔，培养结束后收集细胞悬液，做细胞涂片，行TUNEL法处理及染色，并以二氨基联苯胺显色。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，分析细胞凋亡率。1.5流式细胞仪(FCM)检测细胞内Bcl-2和Bax的变化4umol/L的MS-275分别处理细胞12、24、48h,收集后4%多聚甲醛固定，PBS液漂洗2次，加入1.5mL破膜剂透化15min后，离心去上清，重悬于150uL破膜剂中,分别加入Bcl-2和Bax的单克隆抗体，留取空白对照(不加单抗)，避光反应30min,PBS漂洗2次，每管加入FITC荧光标记的二抗，避光反应30min,PES漂洗2次，上FCM检测。1.6统计学方法采用SPSS15.0统计软件进行分析，计量资料数据以均数土标准差(x±s)表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P0.05)o见表lo3讨...