：Q356.1文献标志码：A:重组人胸腺肽«1在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定尹凤红12,肖清江2,周卫东2,陈清四1(1.厦门大学生命科学学院，福建厦门361102；2.厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361022)摘要：采用大肠杆菌作为宿主表达重组人胸腺肽5(出皿)融合蛋白，纯化获得rhTa,并对其鉴别.于300L发酵罐进行小试发酵表达rhTaj融合蛋口；经IPTG诱导，离心发酵液收集菌体，菌体经破碎、离心、亲和层析捕获，获得融合蛋白；每升发酵液可获得约170mg硫氧环蛋白■胸腺肽山融合蛋白.融合蛋白经肠激稱酶切后、经亲和层析、反相层析、体积排阻层析等纯化步骤，获得高纯度rhTa1;通过本纯化工艺获得的「hid原液经SDS-PAGE和HPLC-SEC的检测纯度均大于99%；采用玫瑰花结形成率测定rhT®活性与市售化学合成胸腺肽(H达仙)标准詁一致；质谱分析分子质量为3066.59u,分子质量大小与去乙酰化的rhTai理论分子质量(3066u)—致；N端测序结果与理论值一致.说明本工艺可实现工业化规模牛产.关键词：重组人胸腺肽山蛋白；表达；纯化.收稿日期:2015-03-30基金项目:国家高技术研究发展(863)计划(2007AA021604)*通信作者：chenqx@xmu.edu.cn胸腺素山（Thymosin-alphai，Tai）作为免疫调节因子，可以启动T淋巴细胞的成熟，刺激分泌干扰素及各种淋巴细胞介素，以及增强自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性.对Ta,的临床研究主要集中在治疗乙型肝炎及内•型肝炎方面，能够显著增强机体免疫力，对肝炎病毒的复制繁殖具有显著的抑制作用[，-3];也有有关Ta）治疗肺癌等肿瘤及其他免疫缺陷疾病的报道[4'5].1977年由Goldstein等首次在胸腺组织内发现.人胸腺肽血是由28个氨基酸组成，N端乙酰化的酸性多肽,其相对分子质量为3108u>等电点为4.2、分子中有6对重复氨基酸残基；氨基酸序列为：N-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C^6^.H前人胸腺肽山生产工艺主要有两种：一种是生化提取法，另一•种是化学合成法.生化提取材料受限，有效成分胸腺肽山含量低（小于1%）,成本高；化学合成的胸腺肽山虽然已经临床应用，但价格昂贵，在合成过程小污染环境.当前临床用药以合成法牛产的胸腺五肽和Ta,为主，其销售金额占据国内该类药物93%的市场份额⑺.采用基因工程技术牛产的rhTai通过查询CFDA暂未有获批产品.有关基因工程技术表达纯化的rhTa.暂时还停留在实验室水平，发酵规模从摇瓶至20L不等凶刃.本文采用基因工程技术，构建高效表达rhTai的表达菌株，在中试规模下，发酵表达并分离纯化，获得高纯度、高活性的rhTa,,为rhTai产业化大牛产打下坚实的基础.1材料和方法1.1材料大肠杆菌TOP10/pThioHisA-Taj基因工程菌株由本实验室构建并保存；酵母提取物和蛋白月东为Oxoid公司产品，内烯酰胺为Promega公司产品；ChelatingSepharoseFastFlow、QSepharoseFastFlow>SOURCE30RPC及G・25填料为GE公司产品；Ta】标准品（Fl达仙）购自SciClonc；其它试剂均为国产分析纯.实验使用主要仪器：30L、300L全自动发酵罐，B.BraunBiotech公司；全温振荡器，哈尔滨东明医疗器械厂；离心机，BECKMAN公司；P2B005A01超滤膜，Millipore公司；Basic100蛋白纯化仪，GE公司；MALDI-TOFMS,Bruker公司；N端蛋白序列分析仪，岛津公司；1.2方法1.2.1rhT«!融合蛋白的发酵表达取rhTai工程菌株TOPlO/pThioHisA-Tai，按1:400（体积比）接种于150mLLB培养基/1000mL三角瓶,37°C、200〜250rpm培养6〜8h为一级种;一级种子按1：200（体积比）接种至24LLB培养基/30L种子罐，37°C、200〜250rpm培养6〜8h为二级种.二级种按1：6（体积比）接种到含150LLB培养基的D300发酵罐中,37°C,DO30%〜60%培养，待菌液浓度达OD6oonm=3.O,用含1mmol/LIPTG的氮源补料液1.5L于2h内流加诱导，过程中补加碳源或2mol/LNaOH以维持pH7.0,诱导总时长约7h.1.2.2菌体收集和破碎发酵完毕,离心收集菌体,菌体用pH8.0的20mmol/LNaCl,50mmol/LTris-HCl缓冲液重悬后采用35MPa高压破碎2次;再用高速冷冻离心机以10°C,10000rpm离心40min,获得JL清液.1.2.3rhTaj融合蛋白的捕获初步纯化离心上清液,上样ChelatingSepharoseFastFlow...