食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定1范围本标准规定了食品中维生素A和E的两种测定方法－反相高效液相色谱法和正相高效液相色谱法。本标准规定了食品中维生素D的两种测定方法－液相色谱—串联质谱法和高效液相色谱法。本标准第一法适用于各类食品中维生素A和E的测定，本标准第二法适用于各类食用油、坚果、豆类和辣椒粉等天然食物中维生素A和E的测定，本标准第三法适用于各类食品中维生素D2和D3的测定，本标准第四法适用于各类强化食品中维生素D2或D3的测定。第一法食品中维生素A和E的测定反相高效液相色谱法2原理试样中的维生素A及维生素E经皂化、提取、净化、浓缩后，用高效液相色谱C30或PFP反相柱将维生素A、维生素E的四种生育酚异构体与其他杂质分离，经紫外检测器或荧光检测器检测，外标法定量。3试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。3.1试剂3.1.1无水乙醇（C2H5OH）：经检查不含醛类物质，检查方法参见附录C。3.1.2抗坏血酸（C6H8O6）。3.1.3氢氧化钾（KOH）。3.1.4乙醚（（CH3CH2）2O）：经检查不含过氧化物，检查方法参见附录C。3.1.5石油醚(C5H12O2)：沸程为30℃～60℃。3.1.6无水硫酸钠（Na2SO4）。3.1.7pH试纸(范围1－14)。3.1.8甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.9Taka-淀粉酶：活力单位≥100U/mg。3.2试剂配制3.2.1氢氧化钾溶液（50g/100g）：称取50g氢氧化钾，加入50ml水溶解，冷却后，储存于聚乙烯瓶中。3.2.2石油醚-乙醚溶液（1+1，体积比）：200mL石油醚，加入200mL乙醚，混匀。3.3标准物质3.3.1维生素A标准物质：视黄醇（C20H30O）：纯度≥95%。3.3.2维生素E标准物质：a-生育酚（C29H50O2）,纯度≥95%；ß-生育酚（C28H4802）,纯度≥95%；γ-生育酚（C28H4802）,纯度≥95%；δ-生育酚（C27H4602）,纯度≥95%。3.4标准溶液配制3.4.1维生素A标准贮备溶液（0.500mg/mL）：准确称取25.0mg维生素A标准物质，用无水乙醇溶解于50mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为0.500mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在-20℃下避光保存。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校准（校准方法参见附录A.1）。3.4.2维生素E标准贮备溶液（1.00mg/mL）：分别准确称取a-生育酚、-ß生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚各50.0mg，用无水乙醇溶解于50mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液浓度约为1.00mg/mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后，在-20℃下避光保存。临用前将溶液回温至20℃，并进行浓度校准（校准方法参见附录A）。3.4.3维生素A和维生素E混合标准溶液中间液：准确吸取维生素A标准贮备溶液1.00mL和维生素E标准贮备溶液各10.00mL于同一50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此溶液中维生素A浓度为10.0μg/mL，维生素E各生育酚浓度为200μg/mL。3.4.4维生素A和维生素E标准系列工作溶液分别准确吸取维生素A和维生素E混合标准溶液中间液0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，该标准系列中维生素A浓度为0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、6.00μg/mL，维生素E浓度为10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL、120.0μg/mL。4仪器和设备注：使用的所有器皿不得含有氧化性物质。分液漏斗活塞表面不得涂油。4.1分析天平，感量为0.1mg。4.2恒温水浴振荡器。4.3旋转蒸发仪。4.4氮吹仪。4.5紫外分光光度计。4.6分液漏斗萃取净化振荡器。4.7高效液相色谱仪，带紫外或二极管阵列检测器或荧光检测器。5分析步骤5.1试样制备将一定数量的样品按要求经过粉碎、均质、缩分后，储存于样品瓶中，避光冷藏，尽快测定。5.2试样处理注：使用的所有器皿不得含有氧化性物质；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作；提取过程应在通风柜中操作。5.2.1皂化5.2.1.1低淀粉样品准确称取2-5g（精确至0.001g）经均质处理的固体试样或50g（精确至0.01g）液体试样于150mL平底烧瓶中，固体试样需用约20mL温水溶解，加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT，混匀，加入30mL无水乙醇，加入10-20mL氢氧化钾溶液，边加边振，混匀后于80℃恒温水浴震荡回流皂化30min，皂化后立即用冷...