活性氧在乳香挥发油抑制结肠癌细胞增殖中的作用郝雪微1阮莹2刘欣宇1顾园竹1李金桐1(1哈尔滨医科大学大庆校区医学检验与技术学院黑龙江大庆163000)(2哈尔滨医科大学药学院黑龙江大庆163319)【摘要】目的：研究活性氧在乳香挥发油抑制结肠癌细胞增殖中的作用。方法：用MTT法检测乳香挥发油对结肠癌细胞SW480的抑制率，用流式细胞术检测细胞内ROS含量及细胞的凋亡率。结果：乳香挥发油对结肠癌细胞有抑制作用，同时使细胞内ROS含量增加，凋亡率增加，加入GSH后可以减少ROS含量，减少凋亡率。结论：乳香挥发油可以抑制结肠癌细胞的增殖及诱导凋亡，GSH可以通过减少活性氧含量减少细胞凋亡。【关键词】乳香挥发油；人结肠癌细胞SW480；活性氧；凋亡【】R34【文献标识码】B【】1003-5028(2015)5-0235-021实验材料药品与试剂：乳香挥发油为课题组之前制备[2],成分大多为单帖、倍半帖、醇及酯类等，其中含量最高的成分为乙酸辛酯、橙花叔醇异丁酯、3,7,11-三甲基-1,6,10-|匸碳三烯・3■醇甲酸酯及beta;■榄香烯，含量分别为34.660%、18.290%、9.612%和5.614%o左旋谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)购于Sigma公司。MTT,活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS)检测试剂盒＞AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天牛物技术公司。细胞及培养:人结肠癌细胞SW480细胞为木室保存，接种在含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mu;g/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，在37°C,5%的C02环境下培养。2实验方法2.1MTT测定细胞的增殖活性取对数生长期的SW480细胞，以l105个/ml接种于96孔板(100mu;l/孔)，培养过夜后，加入不同浓度的乳香挥发油及活性氧清除剂(GSH),实验分组为:Control>EOF低剂量(20mu;g/ml)>EOF高剂量(40mu;g/ml)>GSH(10mu;g/ml)、EOF低剂量(20mu;g/ml)+GSH(10mu;g/ml)、EOF高剂量(40mu;g/ml)+GSH(10mu;g/ml)；复设3孔。药物作用12小时,弃培养基,向每孔分别加入20mu;l的5mg/ml的MTT存储液,并于37°C孵育4小时。之后向每孔加入150mu;l的DMSO,酶标仪570nm波长处测定吸光度值A。按以下公式计算抑制率(IR)：IR二⑴实验组平均吸光度A值/对照组平均吸光度A值)100%o2.2检测ROS的生成量取对数生长期的SW480细胞，接种于6孔板培养皿中。按2.1中分6组，12小吋后离心收集细胞,并用200mu;l的RPMI1640培养液制成单细胞悬液。然后加入10mu;lROS探针于37°C孵育45分钟，最后用PBS缓冲液清洗以出去未结合探针。用BDFACsAriaI型流式细胞仪通过荧光密度来检测ROS的含量。GSH于乳香挥发油作用前1小吋进行预处理。2.3通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率将肿瘤细胞按照l105/ml的浓度接种到6孔板中，培养12h后按以上分组计量加药，每个药物浓度设置3个平行孔。药物作用12h后用预冷的PBS清洗细胞两次，用结合液重悬细胞并加入AnnexinV-FITC避光孵育10min,离心沉淀细胞后用结合液重悬，并加入PI冰上避光孵育5minz用流式细胞仪检测细胞凋亡率。2.4统计学方法所有实验结果均是以3次独立实验数据分析所得。采用SPSS13.0统计学软件进行t检验及方差分析。3结果3.1乳香挥发油对SW480细胞的增殖抑制结果表明乳香挥发油对细胞抑制呈剂量依赖性(图1),分别使用浓度的20mu;g/ml和40mu;g/ml的挥发油作用12h后抑制率分别为(22.8plusmn;3.1)%和(46.1plusmn;4.刀。在使用活性氧清除剂GSH后，抑制率减少到(18.7plusmn;2.5)%和(41.4plusmn;5.4)%。图1乳香挥发油及GSH对细胞的抑制作用(vsControl:**P《0.01,*P《0.05;vsEOF(L):AP《0.05;vsEOF(L)+GSH:▲▲P《0.01)3.2乳香挥发油诱导凋亡与ROS的生成增加有关用流式细胞仪检测乳香挥发油对SW480细胞内的ROS的生成的影响(图2)o横坐标荧光强度代表ROS的生成量。结果表明乳香挥发油处理的SW480细胞ROS增加呈剂量依赖性(EOF(L)vsControl,P《0.01;EOF(H)vsControl,P《0.01;EOF(H)vsEOF(L),P《0.05),而加入GSH可以减少ROS的生成(EOF(L)+GSHvsEOF(L),P《0.05;EOF(H)+GSHvsEOF(H),P《0・05)。图2乳香挥发油和GSH对细胞作用下的ROS含量3.3流式细胞仪检测乳香挥发油SW480细胞的凋亡的影响乳香挥发油作用细胞12h后通过流式细胞仪检测结果显示，对照组、低剂量组和高剂量组的细胞早期凋...