实时定量pcr评价小鼠胸腺功能方法的建立 .doc_百替生物

实时定量PCR评价小鼠胸腺功能方法的建立作者:张华华;曾耀英;何贤辉;刑飞跃(暨南大学组织移植与免疫实验中心,广东广州510632)摘要:目的建立实时定量PCR检测小鼠胸腺及脾脏T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环(sjTRECs)水平的方法,推测其中的初始T细胞的数目,评价胸腺功能,从而为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。方法提取小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞基因组DNA,PCR扩增目的片段。纯化构建标准质粒的RAG2片段,构建标准重组质粒并鉴定。优化PCR体系后,实时定量PCR反应建立标准曲线,并检测不同品系(BALB/c和C57BL/6)成年小鼠胸腺及脾脏淋巴细胞sjTRECs含量。结果成功构建标准质粒。确定最适实时定量PCR反应条件后,在实时定量PCR中建立可信度高的标准曲线。建立的方法分析表明,这两个不同品系的sjTRECs含量统计学差异不显著。结论成功建立定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量从而推测其中的初始T细胞数目的方法,为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。关键词:实时定量PCR;T细胞受体删除环;幼稚T细胞中图分类号:Q93文献标识码:A文章编号:1673-4254(2006)01-0062-04Real-timequantitativePCRforevaluatingmurinethymicfunctionZHANGHua-hua;ZENGYao-yin;HEXian-hui;XINGFei-yueInstituteofTissueTransplantationandImmunology,Ji’nanUniversity,Guangzhou510632,ChinaAbstract:ObjectiveToestablishareal-timequantitativePCRmethodfordetectingthelevelsofthesignaljointTcellreceptorexcisioncircles(sjTRECs)inmurinethymocytesandspleenlymphocytesfordeterminingtheamountofnaveTcellsandevaluatingthethymicfunction.MethodsThegenomicDNAwasextractedfrommurinethymocytesandsplenocytesforPCRamplificationofthetargetfragments.AfterpurificationofthePCRproduct,therecombination-activatinggene2(RAG2)fragmentwasclonedintopGEMT-Easyvectortoconstructthestandardplasmid.AfterPCRoptimization,thestandardcurvewasobtainedandthesamples(thymocytesandsplenocytesofBALB/candC57BL/6mice)weredetectedforsjTRECsbyreal-timequantitativePCR.ResultsThestandardplasmidwascorrectlyconstructed,andthestandardcurvewithhighreliabilitywasobtained.NostatisticaldifferencewasobservedinsjTRECcontentsintheTlymphocytesbetweenthetwomousestrains.ConclusionsReal-timequantitativePCRforsjTRECanalysisisestablishedsuccessfully,whichoffersanimportantmeansforthymicfunctionanalysisandareliablemodelestablishmentforstudythethymus.Keywords:real-timepolymerasechainreaction;Tcellreceptorrearrangementexcisioncircles;naiveTcells收稿日期:2005-04-06基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(G1999054303,G2000057006);国家自然科学基金重点项目(30230350,39930230);广东省“十五”重大科技专项(A302020204)SupportedbyNationalKeyBasicScienceDevelopmentProgram(G1999054303,G2000057006),NationalNaturalScienceFoundationofChina(30230350,39930230),andgrantsforKeyScienceandTechnologyResearchProjectoftheTenthFive-yearPlanofGuangdongProvince(A302020204)作者简介:张华华(1977-),女,电话:020-85220732,E-mail:huahuazhang@126.com通讯作者:曾耀英胸腺是T细胞发育、分化、成熟,并将幼稚T细胞向外周T细胞库输出的场所。T淋巴细胞负责细胞免疫,起免疫监视和免疫自稳的作用。因此胸腺的免疫功能在抗衰老、抗感染、抗肿瘤及自身免疫性疾病中起着重要作用[1]。目前许多研究者致力于胸腺功能方面的研究,期望提高个体免疫力,并有效的抵抗衰老。因而对于胸腺功能的真实评价显得尤为重要。自从1998年Douek[2]等首次使用信号结合T细胞受体删除环(sjTRECs)作为指标检测HIV感染病人的胸腺功能以来,sjTRECs逐渐发展成为公认的检测指标。T细胞在胸腺中发育成熟过程中,T细胞受体(TCR)基因按照一定的顺序发生重排。sjTRECs在TCRα基因重排时删除TCRδ基因过程中产生,是染色体外的稳定的DNA...

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