浙江丽水铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶编码基因研究【摘要】目的了解临床分离的铜绿假单胞菌中氨基糖苷类修饰酶编码基因存在状况。方法对临床分离的40株铜绿假单胞菌采用聚合酶链反应(PCR)检测基因［aac(3)II、aac(6′)I、aac(6′)II、ant(3”)I、ant(2”)I］。结果40株菌中aac(6′)I阳性18株(45.0%)、ant(2”)I阳性21株(52.5%)，其余基因均阴性。结论丽水临床分离的铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶编码基因携带率高。【关键词】铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶编码基因PCR中国医院内病原菌耐药监测网资料显示［1］，近年来铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)是临床常见的条件致病菌之一。Pa对包括β内酰胺类和氨基糖苷类在内常用抗菌药物出现多重耐药性，并导致严重的医院感染，给临床治疗带来极大困难。Pa通过获得氨基糖苷类修饰酶钝化氨基糖苷类抗菌药物而耐药［2］。为了解我院Pa医院感染分离株中氨基糖苷类修饰酶编码基因存在状况，对40株Pa进行了aac(3)II、aac(6′)I、aac(6′)II、ant(3”)I和ant(2”)I等5种氨基糖苷类修饰酶编码基因检测研究，现报告如下。1材料与方法1.1菌株40株Pa均分离自浙江丽水市人民医院2004年12月～2005年12月住院病人临床标本。用BioMerieux公司ATB系统鉴定菌种。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。1.2药敏试验采用KB法测定16种抗菌药物的敏感性，并根据美国临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)(2004年版)要求进行抗生素敏感性判断。1.3细菌处理挑纯培养菌落置0.5ml离心管内(内已预置200ng/ml蛋白酶K溶液)，56℃水浴2h，改95℃水浴10min，离心15000r/min30s，移液器吸取上清液移入另一0.5ml离心管作为模板液置入-20℃冰箱备用。1.4基因检测基因检测均采用PCR法，各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为：酶反应体系P1、P2引物各0.5μmol/L，KCl10mmol/L，(NH4)2SO48mmol/L，MgCl22mmol/L，TrisHCl(pH9.0)10mmol/L，NP400.5%，BSA0.02%(wt/vol)，TaqDNApol1U。总反应体积20μl(其中模板液5μl)。热循环参数为：93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。耐药基因检测试剂盒、靶基因PCR引物序列和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。表1靶基因PCR引物序列2结果2.1抗菌药物敏感性试验结果见表2。2.2氨基糖苷类修饰酶编码基因检测40株Pa中aac(6′)I阳性18株(45.0%)、ant(2”)I阳性21株(52.5%)，其余基因均为阴性。图1为aac(6′)I基因PCR产物电泳图，图2为ant(2”)I基因PCR产物电泳图。2.3与国内三家医院检测结果比较结果见表3。【参考文献】氨基糖苷类(aminoglycosides)抗生素虽有一定程度的肾毒性和耳毒性,但由于具有快速的杀菌作用、抗菌谱广、疗效显著，在医学临床和畜牧兽医业得到广泛应用。但由于泛用和过度使用氨基糖苷类药物耐药问表240株Pa对16种抗菌药物的敏感性表3与国内三家医院铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶编码基因检测结果比较题随之凸现。该类药物是通过与核糖体亚单位的结合而抑制蛋白质合成，从而杀灭细菌。细菌对该类药物耐药是因为产氨基糖苷类修饰酶［2］、细菌16SrRNA基因甲基化酶(编码基因rmtA)［6］和氨基糖苷类抗生素作用靶位16SrRNA基因突变而致［7］，其中前者为主要原因。按酶功能可分成乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(ANT)三类。常见的氨基糖苷类修饰酶编码基因有aac(3)II、aac(6′)I、aac(6′)II、ant(3”)I和ant(2”)I等5种。本组40株Pa中aac(6′)I阳性18株(45.0%)、ant(2”)I阳性21株(52.5%)，其余基因均为阴性。氨基糖苷类与β内酰胺类药物合用一直为治疗Pa感染的一线药物。本研究40株Pa氨基糖苷类和β内酰胺类药物耐药性较高，氨基糖苷类修饰酶编码基因检测显示，氨基糖苷类药物耐药表型与基因型相符。与国内三家医院铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶编码基因检测结果比较显示，不同医院会有差别。致谢：本研究得到无锡市克隆遗传技术研究所糜祖煌老师的指导，特此...