高效液相色谱法（HPLC）测定保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA摘要：建立了一种快速测定保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA含量的HPLC分析方法。以C18（HypersilODS25μm）色谱柱为固定相，以缓冲液A（0.2mol/L磷酸钠，pH=5）和缓冲液B（800mL0.25mol/L磷酸钠，pH=5和200mL乙腈的混合物）为流动相，梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温25℃，采用紫外检测器（254nm）进行检测。结果表明：该方法可以在17min内实现Acetyl-CoA与其他物质完全分离和定量，Acetyl-CoA在0.011~0.359μmol/mL范围内的线性关系良好，回归方程线性相关系数R2=0.9995，检出限（以信噪比（S/N）为3计）为0.28mg/L，定量限（以S/N为10计）为0.32mg/L。该方法用于保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA含量的测定，相对标准偏差（n=6）为0.75%，重现性良好，三个水平的加标回收率为94.8%~103.3%，该方法适用于保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA快速、高效分离和定量。关键词：高效液相色谱，保加利亚乳杆菌，Acetyl-CoADeterminationofintracellularAcetyl-CoAinL.bulgaricusbyHPLCAbstract：Ahighperformanceliquidchromatographic（HPLC）methodforthedeterminationofAcetyl-CoAinLactobacillusbulgaricuswasdeveloped.ThestationaryphaseusedwereC18（HypersilODS25μm）chromatographiccolumnandthetwomobile-phasesolventsusedwerebufferA（0.2mol/Lsodiumphosphate，pH5）andbufferB（800mLof0.25mol/Lsodiumphosphatemixedwith200mLpH5ofacetonitrile），gradientelutionandataflowrateof1mL/min，temperatureofcolumnat25℃，theUVdetectorwasemployedtomonitorcolumneffluentat254nm.Resultsindicatedthat：Acetyl-CoAandothersubstanceswerecompletelyseparatedanddeterminedin17min，thelinearcorrelationcoefficientswereabove0.9995intherangeof0.011~0.359μmol/mL.ThelimitofdetectionofacetylcoenzymeAwas0.28mg/L，thelimitofquantitationofacetylcoenzymeAwas0.32mg/L.Undertheseoptimizedconditions，therecoveryoftheAcetyl-CoAinLactobacillusbulgaricusatthreespikedlevelswereintherangeof94.8%~103.3%withtherelativestandarddeviations（n=6）of0.75%.ThismethodwasfastandaccurateforthequantitativeanalysisoftheAcetyl-CoAinLactobacillusbulgaricus.Keywords：highperformanceliquidchromatography（HPLC）；Lactobacillusbulgaricus；Acetyl-CoA：TS201.3文献标识码：A：1002-0306（2013）22-0058-05收稿日期：2013－06－04*通讯联系人作者简介：李培照（1986-），男，硕士研究生，研究方向：乳酸菌代谢。基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助课题（20122325120022）；国家自然科学基金项目（31201397）。保加利亚乳杆菌与人类生活关系密切，无论在食品发酵，还是工业乳酸发酵以及医疗保健领域，都被广泛应用，其中最重要的是在牛乳发酵剂方面的应用[1-2]。这些应用都与保加利亚乳杆菌的代谢有直接关系，乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）是三大营养物质糖、脂肪、蛋白质代谢的枢纽物质，是代谢途径中的一种重要辅因子，参与微生物中上百个中间代谢反应[3]，如：脂肪酸的合成与分解、氨基酸代谢、生酮作用、甾醇合成和萜类代谢[4-6]，它是代谢中所有大分子的“接受、装运部门”，并且调控代谢中一些关键酶[7]。在保加利亚乳杆菌中Acetyl-CoA主要有三大去向：转化成乙醛（一种重要风味物质）、转化成丙二酰辅酶A，进入脂肪酸合成途径以及转化成乙酰乙酰辅酶A，进入甲羟戊酸途径。这三大途径在保加利亚乳杆菌的生理性能方面各自发挥着重要作用。例如，当保加利亚乳杆菌处在恶劣环境下时，可通过提升胞内Acetyl-CoA的含量，调节脂肪酸合成途径来改变细胞膜构成成分及流动性以抵抗不利因素，维持生存。因此，Acetyl-CoA的定量对这三大途径碳流量分配的研究有重要作用，可以通过调节不同途径的代谢通量来满足所需，而胞内Acetyl-CoA的定量是其研究的前体。综上所述，建立一种快速、高效定量Acetyl-CoA58分析检测2013年第22期Vol.34,No.22,2013的方法对物质代谢的研究有一定的意义。先前报道的短链酰基辅...