时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用武学成1,2(综述),何林1,周克元2(审校)(1.深圳人民医院检验医学部,广东深圳518001;2.广东医学院,广东湛江524001)中图分类号:R44616文献标识码:A文章编号:100622084(____)0720434203摘要:标记免疫分析技术的出现使临床生化分析由常量分析向微量分析转变。20世纪80年代出现的时间分辨荧光免疫分析技术,以其独特的优势成为最有发展前途的非放射免疫标记技术。本文主要介绍时间分辨荧光免疫技术基本原理、基础试剂、基本技术以及近年来临床应用。关键词:时间分辨荧光免疫分析技术;铕;标记技术TheResearchandClinicalApplicationofTime2resolvedFluoroimmunoassayWU_ue2cheng1,2,HELin1,ZHOUKe2yuan2.(1.TheMedicalLaboratoryDepartmentofShenzhenPeople′sHospital,Shenzhen518001,China;2.GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China)Abstract:Themarkedimmunoassaytechniquegivesthechangesfrommacroanalysistomicroanalysis.Time2resolvedfluoroimmunoassaytechnologyisanon2radio2immunitylabelingtechniquehavingmostperspectivefuturebecauseofitsuniqueadvantagesince1980s.Thisarticlereviewedsomeaspectsaboutitincludingfundamentalprinciple,basicreagent,basictechniqueandtheitsclinicalapplicationinrecentyears.Keywords:Time2resolvedfluoroimmunoassay;Europium;Labelingtechnique随着生物标记技术的不断进步,免疫分析技术得到了长足的发展。免疫分析技术逐步由放射免疫分析技术向非放射免疫技术转变。在此期间,涌现了一大批非放射免疫技术,例如酶免分析技术、化学发光免疫分析技术、时间分辨荧光免疫分析技术(time2resolvedfluoreimmuoassay,TRFIA)等。但是从灵敏度来说只有时间分辨荧光免疫分析技术可与放射免疫媲美。TRFIA是20世纪80年代迅速发展起来的的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术。1时间分辨荧光免疫分析技术的基本原理TRFIA是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分不需要)在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。2时间分辨荧光分析技术简介TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双功能螯合剂、分析缓冲液、增强溶液。基本技术包括包被技术、标记技术、反应模式。2.1基础试剂2.1.1示踪剂的选择和使用所使用的稀土元素主要位于元素周期表中的ⅢB族,包括钪(scandium,SC)、钇(yttrium,Y)和镧系元素。到目前为止,只有铕(europium,Eu)、铽(terbium,Tb)、钐(samarium,Sm)、钕(neodymium,Nd)、镝(dysprosium,Dy)等5种被用作TRFIA示踪剂,尤以Eu3+常用。一般用Eu2O3制备成EuCl3,再经纯化和常温真空抽干,然后干燥保存。用Eu3+等镧系元素作为示踪剂有以下特点:①荧光物质激发光谱曲线的最大吸收波长和发射光谱的最大发射波长之间的差,称为Stokes位移。普通荧光物质荧光光谱的Stokes位移只有几十纳米,激发光谱和发射光谱通常有部分重叠,互相干扰严重。游离铕的荧光信号虽然相当微弱,但当Eu3+与螯合剂形成螯合物时,产生分子内和分子间能量传递,使Eu3+的荧光强度显著增强,Stokes位移达200nm,很容易分辨激发光和发射光,从而排除激发光干扰;②镧系元素与普通的荧光团比较,镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间(decaytime)长,为传统荧光的103～106倍。稀土离子及一些常见荧光物质的荧光寿命(见表1)。镧系元素的荧光不仅强度高,而且半衰期也很长,介于10～1000μs之间。这样,用时间分辨荧光仪测量Eu3+螯合物的荧光时,在脉冲光源激发之后,可以适当的延迟一段时间,待血清、容器、样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量,这时就只存Eu3+标记物的特异性荧光,即通过时间分辨,极大地降低了本底荧光,实现了高信噪比,这是TRFIA高灵敏度和低干扰的原因之一。如果在使用链霉亲合素2...