大肠埃希菌耐药性分析及超广谱内酰胺酶基因检测

大肠埃希菌耐药性分析及超广谱3—内酰胺酶基因检测游春芳1周利民1张肃川2(1自贡市第一人民医院感染科643000;2自贡市第一人民医院检验科643000)【】R978.5【文献标识码】A【】1672-5085(2012)51-0187-02【摘要】目的了解自贡市第一人民医院临床分离的大肠埃希菌的耐药情况及超广谱beta;—内酰胺酶(ESBLs)基因的存在状况。方法对2009年8月〜2010年8月临床分离的154株大肠埃希菌用表型确证试验检测ESBLs,用Kirby-Bauer琼脂扩散法做药物敏感试验,并釆用聚合酶链反应(PCR)检测SHV、CTX-M基因。结果154株大肠埃希菌中耐药率最高的是氨苄丙林(83.12%),其次是头孢唑林(65.58%),亚胺培南、美罗培南全敏感;ESBLs菌株检出率为51.95%;基因检测结果为SHV5株CTX-M70株,SHV+CTX-M3株。结论该院大肠埃希菌株对beta;—内酰胺药物表现出较高的耐药率,且ESBLs基因检出率也较高,故临床应加强对大肠埃希蘭耐药性及耐药基因的监测,严格掌握抗生素的使用指征,防止耐药菌株的传播流行。【关键词】大肠埃希菌耐药性超广谱beta;-内酰胺酶(ESBLs)基因大肠埃希菌是临床分离的革兰阴性杆菌中最常见的菌种,它作为重要的条件致病菌广泛存在于自然界。尤其是超广谱beta;—内酰胺酶(extendspectrumbeta-lactamases,ESBLs}的出现引起了医院感染的爆发流行。木研究收集2009年8月〜2010年8月木院临床分离的154株大肠埃希菌,通过表型确证试验、药物敏感试验及PCR技术,了解木地区大肠埃希菌的耐药情况及超广谱beta;—内酰胺酶(ESBLs)基因的存在状况。1材料和方法1.1菌株实验菌株:154株大肠埃希菌临床分离株(不含同一病例相同部位重复分离株)来自自贡市第一人民医院2009年8月-2010年8月期间感染大肠埃希菌的患者。其中泌尿系统感染84例,呼吸道感染30例,全身感染19例,外科切U感染13例,其他感染8例;全部菌株均重新经VITEK系统(BioMerieux,法国)鉴定确认。标准菌株:大肠埃希菌ATCC25922(购自杭州天和微生物试剂奋限公司)1.2试剂抗生素药敏纸片:氨苄西林、头孢唑啉、头孢毗肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸。(购自杭州天和微生物试剂有限公司)。培养基:M-H琼脂培养基(购自杭州天和微生物试剂有限公司)、LB培养基(购自上海生工)、胰人豆蛋白胨肉汤(购自杭州天和微生物试剂冇限公司)。1.3药物敏感试验采用KB纸片扩散法,药敏结果均按照美国CLSI/NCCLS2006年标准判定,以敏感(S)、中介(1)、耐药(R)报告结果。1.4ESBLs表型确证试验参照CLSI/NCCLSM2-A8(2003年版本)推荐的纸片确证扩散法标准进行,采用头孢噻肘(30mu;g),头孢噻肘/克拉维酸(30mu;g/10mu;g),头孢他口定(30mu;g),头孢他陡/克拉维酸(30mu;g/10mu;g)纸片检测,对两组中任何一个药物加克拉维酸的抑菌圈直径与不加克拉维酸的抑菌圈直径相比,差值ge;5mm吋,可确证该菌株产ESBLs。1.5质粒提取采用UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒DNA。1.6PCR反应及琼脂糖凝胶电泳根据SHV、CTX-M基因的序列设计二对引物,采用UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒DNA用于PCR反应模板。PCR反位体系(25mu;l):2TaqPCRMasterMix12.5mu;l[包括:0.1U/mu;lTaqPolymerase,500mMdNTP,20mMTris-CI(pH8.3),lOOmMKCI,3mMMgCI2等],上、下游引物(10mu;M)各lmu;l,质粒DNA模板5mu;l,ddH205.5mu;l。PCR反应条件:94°C预变性5min,94°C变性45s,53°C退火45s,72°C延伸60s,共32个循环,然后721延伸51^〜扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,紫外线检测仪观察结果。表lESBLs基因引物序列1.7结果分析文中的数据和表格采用Excell进行分析。2结果2.1154株大肠埃希菌的耐药情况(表2)表2154株大肠埃希菌的耐药情况抗生素RS氨辛西林128(83.12%)26(16.88%)头孢唑啉101(65.58%)53(34.42%)头孢西丁8(5.19%)147(95.45%)头孢噻肟81(52.64%)73(47.40%)头孢他啶31(20.13%)123(79.87%)头孢毗肟48(31.17%)106(68.83%)亚胺培南0154(100%)美罗培南0154(100%)头孢哌酮/舒巴坦27(17.53%)127(82.47%)哌拉西林/他唑巴坦13(8.44%)141(91.56%)阿...

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