CK2参与调控肺癌细胞中TGF-通路的研究

CK2参与调控肺癌细胞中TGF-3通路的研宄(1辽宁省大连市第五人民医院胸外二科辽宁大连116021)(2广东省中山大学肿瘤防治中心胸外科510060)(3美国加州大学旧金山海伦迪勒癌症中心胸外科94143)【摘要】蛋白激酶CK2在多种人类恶性肿瘤细胞中处于过表达状态。TGF-&beta;信号通路在肺癌中失调控,并被证实与肿瘤转移及患者不良预后密切相关。木研究表明,在人类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中,CK2正性调控TGF-&beta;信号通路。首先我们证实,TGF-&beta;信号通路转录因子Smad2在原发肺癌组织标木中表达升高;然后我们发现,在NSCLC细胞系中,抑制CK2可以下调Smad2表达及水平及转录活性,继而下调多种TGF-&beta;信号通路靶基因(TGF&beta;lll,GDF11,KLF10)表达水平。在划痕实验中,抑制CK2&alpha;后,NSCLC细胞表现出更低的侵袭生长潜能;接下来,我们证实Smad2表达及转录活性均下调,通路靶基因表达水平下降:进一步的蛋白降解实验表明,抑制CK2&alPha;促进Smad2蛋白降解。我们首次报道,在NSCLC中,CK2正性调控TGF-&beta;信号通路,抑制CK2可下调TGF-&beta;信号通路活性。【关键词】CK2&alpha;;TGF-&beta;信号通路;CX-4945;Smad2;非小细胞肺癌(NSCLC)【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】1007-8231(2016)27-0066-031.研究背景1.1CK2酪蛋白激酶2(caseinkinase2)是一类能催化肽链中邻近酸性氨基酸残基的丝氨酸/苏氨酸磷酸化的酶,具有广谱底物特异性,在细胞的生存、生长、转化、增殖和肿瘤的发牛.中都发挥了重要的作用,一旦失调,细胞无限增殖,产生癌变1。在包括肺癌的多种恶性肿瘤中,过表达的CK2&alpha;可以作为提示预后不良的因素2。研究表明,CK2调控肿瘤细胞内多种信号传导,如PI3K,NFkB,Wnt3。近年来,己有多种针对CK2的抑制物被开发,其中CX-4945(特异性小分子抑制剂)和CIGB-300(多肽类抑制物),已进入一期临床试验,其疗效及安全性也初步被证实。1.2TGF-&beta;信号通路与肿瘤发生发展转化生长因子-&beta;(transforminggrouthfactor-&beta;,TGF-&beta;)在多种生物学行为(如细胞增殖、癌症转移)中发挥着重要的作用。TGF-&beta;l是0前研宄得最深入活跃的一型,通过一系列激活过程,TGF-&beta;l与相应受体结合进行信号传导,通过下游的信号调节蛋闩Smad2和Smad3对靶基因进行调节4。在肿瘤发生的早期阶段,TGF-&beta;信号抑制上皮细胞生长,在癌症进展期,TGF-&beta;失去对细胞生长的抑制作用5。1.3CK2与TGF-&beta;在人类恶性肿瘤中,CK2通过磷酸化机制参与多种信号通路的调控。本项研宄探讨人类肺癌细胞中CK2与TGF-&beta;通路的关系,并对其可能的调控机制进行研究,寻找更冇效地肿瘤治疗靶点,并为CK2靶点药物的应用提供新的理论依据。2.研究方法2.1细胞培养、小分子处理、免疫组织化学人类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中生长。以不同浓度的CK2小分子抑制剂处理细胞,培养48小吋后收集细胞。标本来自于大连市第五人民医院原发肺癌患者的手术切除。应用Anti-Smad2和anti-phosphorylatedSmad2抗体对标本进行炎色,使用如下评分系统:不炎色;+、弱染色;++,中染色;+++、强染色。2.2siRNA、质粒DNA转染以CK2&alpha;siRNA和对照siRNA分别处理细胞,使用LipofectamineRNAiMAX进行转染;质粒选用pcDNA3.1-CK2&alpha;和controlpcDNA3.1-LacZ,转染48小时后收集细胞进行RNA及蛋白分析。2.3RNA提取、实时定量荧光PCR、WesternBlot分析收集RNA,定量检测基因包括Smad2、TGF&beta;lll、GDF11、KLF10、Smad7。BCA法测定蛋白含量,一抗选用anti-Smad2和anti-GAPDH。经二抗处理后,蛋白检测应用ECL印记分析系统进行发光分析。2.4荧光素酶报告基因分析将野生型Smad和突变型Smad质粒转染至细胞内,共转染管家基因RenillaluciferasepRL-TK质粒。24小吋后进行焚光检测。2.5统计分析数据分析使用三次独立分析数据的均数&plusmri;标准差(SD),组间差采用Student&rsquo;st-检验,以P<0.05表示有显著性差异(*P<O.O5,**P<0.01)o3.实验结果3.1NSCLC中TGF-&beta;被激活与肿瘤周边正常组织相比,95例肺癌标本中,93例的TGF&beta;lmRNA表达水平升高(Figure1A),9...

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