人工合成抗菌肽对口腔细菌抗菌性能的初步研究刘奕费伟王丽娜等[摘要]目的评价人工合成抗菌肽（十肽）对口腔常见感染性疾病主要致病菌的抑菌活性。方法采用琼脂扩散法及液体稀释法体外评价十肽对变异链球菌、表兄链球菌、嗜酸乳杆菌、血链球菌、格氏链球菌、黏性放线菌、内氏放线菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌、具核梭杆菌、伴放线嗜血杆菌及白色假丝酵母菌的抑菌性能，并测定十肽对变异链球菌的时间-杀菌曲线。结果十肽对所选实验菌株均表现出不同的抑菌性能，对主要致龋菌的最小抑菌浓度MIC值为62.5～125μg·mL-1，而对主要牙周致病菌的MIC值为250～1000μg·mL-1，其中，十肽对龋病主要致病菌变异链球菌有较强抑菌作用。时间-杀菌曲线结果显示，十肽作用20min后开始杀菌，30min之后可完全杀灭细菌，且在24h之内无细菌生长。结论新型人工合成抗菌肽十肽对口腔常见感染性疾病主要致病菌具有抑菌性能，其中对致龋变异链球菌的抑菌效果最为明显。[关键词]十肽；抗菌性能；口腔感染性疾病[]R780.2[文献标志码]A[doi]10.7518/hxkq.2014.06.017龋病是在以细菌为主的多种因素作用下，发生在牙体硬组织的慢性、进行性破坏的疾病，龋病及其继发疾病给人类造成很大的危害，被世界卫生组织列为人类重点防治的非传染性疾病。变异链球菌（Streptococcusmutans，S.mutans）是与龋病发生密切相关的主要致病菌，也是牙菌斑生物膜中重要的定植菌。十肽（decapeptide）是从多肽库中筛选出来的一种人工合成的新型抗菌肽，具有较强的抗微生物活性，且作用过程中不产生耐药性。十肽氨基酸序列为KKVVFKVKFK-NH2，其具有的单一氨基酸序列是其主要部分[1]。本研究旨在研究十肽抑制口腔感染性疾病主要致病菌生长的能力，体外评价十肽的抑菌防龋性能，为进一步探索十肽抑制细菌，防止早期菌斑形成的作用机制奠定实验基础。1材料和方法1.1十肽的合成依据十肽的氨基酸序列，采用人工固相多肽合成的方法体外合成十肽并进行质谱鉴定（成都诚诺新技术有限公司合成并鉴定）。1.2主要仪器和设备标准96孔微量板（Sigma公司，美国），光学显微镜（Nikon公司，日本），ProtoCOLSR全自动抑菌环测量仪（Synbiosis公司，英国），CrystalSpecTM比浊仪（BectonDickinson公司，美国），针孔式滤膜过滤器（孔径：0.2μm，无锡赛维商贸公司），厌氧培养箱DY-2（浙江义乌冷冻机总厂），超净工作台（苏州净化设备有限公司），高压蒸汽灭菌机（Sanyo公司，日本）。1.3实验菌株变异链球菌ATCC25175、表兄链球菌6715、嗜酸乳杆菌ATCC4356、血链球菌ATCC10556、格氏链球菌ATCC10558、黏性放线菌ATCC19246、内氏放线菌ATCC12140、牙龈卟啉单胞菌381、中间普雷沃菌ATCC25611、具核梭杆菌10953、伴放线放线杆菌29523、白色假丝酵母菌ATCC10691均由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。1.4实验菌株的培养变异链球菌、表兄链球菌、格氏链球菌、血链球菌、黏性放线菌、内氏放线菌采用TPY培养基培养；嗜酸乳杆菌采用Rogosa培养基培养；牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌、具核梭杆菌、伴放线放线杆菌采用BHI培养基培养；白色假丝酵母菌采用BA培养基培养。1.5方法1.5.1十肽实验液的配制将人工合成的十肽重悬于无菌双蒸水，终浓度为4g·L-1，针孔式滤膜过滤器过滤，-20℃保存备用。1.5.2菌悬液的配制实验菌种冻干株接种于相应固体培养基上复苏，于80%N2、10%H2、10%CO2，37℃下厌氧培养24～48h，白色假丝酵母菌于恒温培养箱37℃需氧培养24h。检查菌落的生长形态，镜检无污染，涂片检查证实为纯培养后，挑取单个菌落于液体培养基中在相同的培养条件下培养增菌，CrystalSpecTM比浊仪测定菌悬液浓度，磷酸缓冲液（PBS）配制浓度为1×108CFU·mL-1和2×106CFU·mL-1的细菌菌悬液备用。1.5.3琼脂扩散实验实验分为阳性对照组（0.1%氯己定）、阴性对照组（PBS缓冲液）、实验组（4g·L-1的十肽实验液）。采用琼脂扩散的方法，制备含菌的培养基，微量加样枪吸取浓度为1×108CFU·mL-1的菌悬液各200μL加入20mL培养基中，充分混匀，铺板（培养皿直径90mm），使细菌菌悬液最终浓度为1×106CFU·mL-1，平均划分3个加样区，打孔器均匀制备加样孔（直径...