桂皮醛诱导HL60细胞分化的机制研宄(1.广东省深圳市南山区人民医院血液科广东深圳518052)(2.华中科技大学同济医学院协和医院干细胞研究与应用中心湖北武汉430022)【摘要】目的：木研究探讨桂皮醛对急性髓细胞白血病细胞HL60的诱导分化作用及其机制。方法：以低浓度桂皮醛作用于体外培养的HL60细胞，流式细胞术(Flowcytometry，FCM)检测细胞周期、细胞表面抗原表达，免疫印迹法检测HL60细胞细胞周期相关蛋白CDC6蛋白表达，激光共聚焦技术检测HL60细胞CDC6蛋白细胞定位。结果：低浓度桂皮醛作用后HL60细胞表面粒细胞分化抗原CDllb表达增加，而CDC6蛋白表达下降，核内部分下降尤为明显。结论：低浓度桂皮醛诱导HL60细胞向成熟粒细胞分化。低浓度桂皮醛诱导HL60分化与细胞周期受阻，细胞周期相关蛋白CDC6表达下降有关。【关键词】桂皮醛；HL60；分化；CDC6【中图分类号】R379.4【文献标识码】A【文章编号】1004-6194(2015)02-0249-01食用香料肉桂提取物的主要活性成分桂皮醛乂称为反式桂皮醛，可对多种恶性肿瘤调亡发挥抑制增殖、诱导凋亡的效应［1-3］。我们前期研宄显示：桂皮醛不仅可诱导白血病细胞凋亡，而且还可诱导慢性髓细胞白血病细胞株K562向单核细胞分化［3-5］,有很好的应用前景。但是，桂皮醛对急性髓细胞白血病细胞的分化研宄尚未见报道。木实验观察桂皮醛诱导HL60细胞分化改变及探讨相关机制，以进一步研究桂皮醛抗白血病的机制。1材料和方法1.1实验对象与主要试剂HL60细胞来自华中科技大学同济医学院协和医院干细胞研宄与应用中心保存。桂皮醛（分子式C9H8O，分子量132.16,纯度大于95%,购自上海国药集团化学试剂有限公司）溶于二甲基亚砜，配成浓度为200mmol/L贮存液，-20°C保存。藻红蛋白（Phycoerythrin,PE）标记的抗人CDllb单克隆抗体（CDllb-PE）和异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocynate,FITC）标记的抗人CD14抗体（CD14-FITC）购自美国BD公司。四甲基异硫氰酸罗丹明（Tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC）标记的抗人CDC6抗体（CDC6-TRITC）、兔抗人抗体CDC6单克隆抗体和兔抗人GAPDH多克隆抗体购自SantaCruz公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自Sigma公司。1.2细胞培养与分组HL60细胞用RMPI1640完全培养液在37°C、5%C02、饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞以2&times;105/ml密度接种（台盼兰检测细胞活性大于98%）。实验组加入桂皮醛使终浓度为20&mu;mol/L,空白对照组加入等体积含二甲基亚砜的RPMI1640（二甲基亚砜浓度与实验组相同，均<0.1%），继续培养，用于以下实验。1.3细胞分化检测细胞培养72h，收集各组细胞，CD14-FITC和CDllb-PE分别标记细胞，流式细胞仪检测。数据经CellQuest软件进行分析。1.4细胞周期检测细胞培养72h,收集各组细胞，70%乙醇固定过夜。细胞周期染液（含PI30&mu;g/L、Rnase5mg/L）重悬，4°C避光过夜，次日上流式细胞仪检测细胞周期分布。数据经CellQuest软件进行分析。1.5Westernblot检测细胞培养72h，收集各组细胞，提取细胞总蛋白。凝胶分离，转膜后加一抗4°C孵育过夜。一抗分别为兔抗人CDC6抗体和兔抗GAPDH抗体（释度均为1:1000），充分漂洗后，加入二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（，稀释度为1:1000）,37"C孵育lh。充分漂洗后在化学放光试剂中反应5分钟，曝光，扫描胶片，输入计算机。1.7激光共聚焦检测细胞培养72h,收集各组细胞，滴片，室温干燥，4%多聚甲醛固定。0.5%TritonX-100室温下破膜10min,洗片后加CDC6-TRITC抗体（稀释度1：50）,4°C避光孵育2-3h。洗片，甘油封片。激光共聚焦显微镜检测。1.8统计学分析所有实验重复3次，实验数据以均数&plUSmn;标准差(x&plusmn;sd)表示，釆用SPSS18.0软件包进行数据分析并t检验。认为P<0.05时具有统计学意义。2结果2.1桂皮酸诱导HL60细胞分化抗原表达用20&mu;mol/L桂皮酸处理HL60细胞72h后，HL60细胞表面CDllb抗原表达增力口，为(47.21&plusmn;3.27)%，与对照组(3.55&plusmn;1.52)%相比，差异有显著性(P<0.01)。HL60细胞用桂皮醛处理前后细胞表面CD14抗原表达无明显改变。2.2桂皮醛对HL60细胞周期的影响20&mu;mol/L桂皮醛作用于HL60细胞72h后，G0/G1期细胞比例明...