两个不同品种肉兔TLR4基因多态性研究张翔宇李金良李旭廷李思聪张敏王吴燕杨锐摘要：TLR4能识别内毒素脂多糖（LPS），在介導革兰氏阴性菌及其LPS的宿主反应中发挥重要作用，是研究肉兔抗病力的重要候选基因。为了研究TLR4在不同肉兔品种的突变情况，设计引物对2个不同肉兔品种的12个个体的TLR4部分编码区进行序列扩增，并比较其序列。结果表明，共检测到3个SNP位点，均为非同义突变。2个非同义位点（G628T和C653A）位于预测蛋白的亮氨酸富集区（LRR）区域。LRR区域发生的非同义突变，尤其是亮氨酸的改变和氨基酸极性的改变可能会影响TLR4对病原的识别，这些SNP位点将有助于肉兔抗病分子标记的研究。关键词：肉兔；TLR4基因；单核苷酸突变；非同义突变；抗病力：S829.1：A：0439-8114（2018）11-0100-03DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2018.11.025Abstract：TLR4coulddetectendotoxinbyidentifyinglipopolysaccharide（LPS）andplayakeyroleinhostdefensemediatedbyGram-negativebacteria（LPS），therefore，TLR4isasignificantcandidategeneforrabbitdiseasesresistanceresearch.Toidentifynucleotidepolymorphismsbetweentwodifferentbreedswedesignedprimerpairsthatamplifiedfragmentsofcodingsequence（CDS）of12individuals，andcomparedthesequences.Comparativesequenceanalysisindicatedthat3SNPswereidentified，allwerenon-synonymousSNPs.TwononsynonymousSNPs（G628TandA653C）werelocatedintheLRRdomainsofthepredictedprotein.ThenonsynonymousSNPsintheLRRdomains，especiallyrelatedtoleucineresidues，maydramaticallyaltertheabilitytoidentifiedextracellularpathogens.Theidentificationofthesepolymorphismsreportedhereincreasestheresourceofgeneticmarkersusefulforassociationanalyseswithdiseaseresistanceandprovidesanimportanttheoreticalbasisfordiseaseresistantbreedingofmeatrabbits.Keywords：meatrabbits；TLR4gene；SNP；nonsynonymousSNPs；diseaseresistanceToll样受体首次在果蝇的胚胎发育中发现，称dToll。随后陆续发现人与其他哺乳动物存在与Toll类似的一组蛋白，称为Toll样受体[1，2]。Toll样受体广泛分布于机体各组织中，在识别病原相关分子模式中起重要作用，形成机体应对病原入侵的“第一道防线”[3]。TLR4是TLRs家族的重要成员之一，可以识别各种病原微生物成分，诱导机体的天然免疫和获得性免疫反应，TLR4基因变异可影响其受体结合配体的功能及其与配体结合以后的信号转导能力，对机体的病原识别和抗病性能具有重要影响[4]。研究表明，TLR4基因多态性与宿主的炎症应答及对传染性疾病的易感性存在关联[5]。TLR4属于细胞表面TLR，其结构分为胞外区、跨膜区和胞内区3个部分。胞外区有18～31个亮氨酸的重复序列（Leucine-richrepeats，LRRs），胞内区由Tol同源结构域（Tolhomologydomain，THdomain）和Toll样受体/白介素-同源结构域（Toll/L-1-receptorhomologousregion，TIR）构成。牛TLR4基因结构及其多态性与乳房炎的相关性研究已有较多报道，TLR4可能在宿主对乳房内感染应答反应中起重要作用[6]。人的TLR4基因多态性与消化系统疾病和呼吸系统疾病存在显著关联。兔TLR4基因多态性与消化系统疾病的易感性存在关联。四川白兔是中国珍贵的本地兔种资源，具有耐粗饲、适应能力强的特点。为了比较四川白兔与其他品种的遗传差异，本研究检测了2个不同品种的12只肉兔TLR4基因的遗传多态性，以期为肉兔TLR4基因的研究提供参考。1材料与方法1.1样品的采集和DNA抽提样品来自2个不同品种（新西兰白兔和四川白兔）的12只肉兔，每个品种各6只，公母各半。采集静脉全血后-20℃保存。另外，采集1只新西兰白兔的腿肌，用于目的片段的确认和扩增条件的优化。利用UniversalGenomicDNAExtractionKit（TaKaRa公司）试剂盒抽提基因组DNA。1.2PCR扩增和SNP的检测采用WebinterfaceforPrimer3（：//frodo.wi.mit.edu/primer3）设计4对引物扩增肉兔TLR4基因的部分编码区，扩增产物部分重叠，引物序列见表1。PCR反应体系为25μL：50～100ng模板DNA，上下游引...