EB病毒相关胃癌组织中VEGF表达的研宄孙萍1(通讯作者)罗兵2周冬梅3(1烟台毓璜顶医院山东烟台264000)(2青岛大学医学院微生物教研室山东青岛266003)(3烟台市烟台山医院山东烟台264001)【摘要】目的:检测EBV相关胃癌(EBVassociatedgastriccarcinomas,EBVaGC)和与之匹配的EBV阴性胃癌(EBVnetativegastriccarcinomas,EBVnGC)VEGF的表达，同时检测EBV相关基因的表达，探讨它们在EBVaGCs发生发展中的作用。方法：选取13例EBVaGCs、45例与之相兀配的EBVnGCs和58例相应癌旁组织作为研宄对象，采用免疫组化技术检测VEGF蛋白的表达；RT-PCR和Southern杂交技术检测EBV相关基因(核抗原EBNA1和EBNA2编码基因，潜伏膜蛋白LMP1编码基因，早期基因BARF1和BHRF1)的表达。结果：①癌组织VEGF阳性率为72.41%(42/58),明显低于相应癌旁组织87.93%(51/58)(P=0.022)；EBVaGC组织中VEGF阳性表达率为84.61%(11/13),明显高于EBVnGC组织68.9%(31/45),两组间差别有统计学意义(χ2=3.928,P=0.047｝②13例EBVaGCsEBNA1mRNA均为阳性，而EBNA2和LMP1mRNA均为阴性；早期基因中有6例BARF1表达阳性，2例BHRF1表达阳性。结论:①EBVaGC及EBVnGC中高表达VEGF，但是EBVaGC中VEGF的表达与血管牛.成和淋巴结转移关系密切程度不如EBVnGC②EBVaGC组织中LMP1和EBNA2表达阴性，与c-myc的表达和细胞增殖无明显相关性，早期基因BARF1和BHRF1可通过转化细胞等作用促进肿瘤的发牛.发展。【关键词】胃癌EB病毒VEGFRT-PCR【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2012)20-0128-03EB病毒(Epstein-BarrVirus,EBV)是重要的致瘤病毒，以往的研宄多集中在EBV与Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金病和免疫缺陷病人的B淋巴细胞瘤等的关系，近年来研宄发现约7〜16%的胃癌组织EBV阳性，EBV感染在胃癌发生发展中的作用也愈来愈受到重视。本研宄采用免疫组化方法检测13例---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---EBVaGCs、45例与之相匹配的EBVaGCs以及相应癌旁组织中VEGF的表达，RT-PCR检测EBV相关胃癌组织中病毒潜伏期基因EBNA1、EBNA2、LMP1以及早期基因BARF1和BHRF1的表达，以探讨EBVaGC中EBV相关基因与PCNA和c-myc基因表达的关系及在胃癌发生发展的作用。1材料和方法1.1研究对象：随机选取青岛大学医学院附属医院、青岛市立医院及烟台毓璜顶医院2008年1月〜2009年12月间185例胃癌患者手术切除的新鲜胃癌组织和相应癌旁组织（距离癌组织5cm以上）制备组织切片，经PCR-Southern和原位杂交检测证实185例胃癌中奋13例EBVaGCs，同吋选择年龄、性别、病理类型和临床分期与之相匹配的45例EBVnGCs作为研究对象。58例胃癌病人平均年龄58岁（31〜81岁），其中男性48例，女性10例，全部病例均经病理诊断证实。1.2主要试剂和耗材：ReverseTranscriptionkit（美国Promega公司），TRIzol试剂（美国GIBCO公司），PCR反应体系（上海生工生物技术服务有限公司），HybOnd-N+尼龙膜（美国Amershampharmacia公司），DigOligonucleotide3’-EndLabilingkit、CSPD、DNAMolecularWeightMarkerVlII,Digoxigenin-Labeled（徳国Roche公司），VEGF兔抗人单克隆抗体、SP通用型染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。1.3EBV相关基因的RT-PCR及Southernblotting检测TRIzol法提取组织总RNA,参照逆转录试剂盒要求的标准条件进行cDNA合成反转录所得cDNA用作PCR反应的模板。EBV潜伏期基因和早期基因特异性引物和探针均参照文献设计［1-3］，由北京赛百胜公司合成，引物和探针序列以及PCR产物长度见表1。应用Roche公司提供的DigOligonucleotide3’-endLabelingKit对寡核符酸探针进行标记,具体步骤按试剂盒要求的标准条件进行。---本文来源于网络，仅供参考，勿照抄，如有侵权请联系删除---PCR反应体积为30μl,反应体系为10×buffer3μl，MgCI21.5mmol/l，dNTPO.lmmol/L,上下游引物各0.5μmmol/L，TaqDNA聚合酶l.OU,cDNA聚合酶1U,cDNA模板3μl,同吋设立阳性对照和阴性对照，阳性对照为EBV阳性的LCL细胞，阴性对照为EBV阴性Ramos细胞系。PCR反应条件为94°C预变性5min;然后94...