•综述•分子生物学技术在病原微生物检测应用的研究进展苗杰，夏涵，黄庆，府伟灵(第三军医大学第一附属医院检验科，重庆400038)关键词：聚合酶链反应；生物芯片；生物传感器；病原微牛物；检测中图分类号：R378文献标识码：A文章编号：100乡4529(2011)14~3088~03病原微生物的检测广泛用于食品工业、水质环境质屋监控和临床疾病的诊断等诸多领域。近年来，已经成为世界各国关注的焦点。传统标准的检测主要依赖于病原菌的分离、培养和表型的鉴定，其整个检测周期需要数天才能完成，且操作步骤繁琐，容易受标木环境等各种因素影响而降低了检测的特异性和灵敏度。尤其是2003年的SARS以及去年甲型II1N1流感病毒的暴发，使病原微生物快速可靠的检测成为H前研究的热点。迄今，以PCR技术、生物芯片和传感器为代表的分子生物学技术在微生物诊断中不断发展，这些方法具有快速、简便、特异、敏感且口动化程度高等优点，能够满足现在临床对于病原微生物检测的需求。笔者就近年来病原微生物分子生物学的主要的检测技术进展作一综述。1聚合酶链反应技术(PCR)自1985年PCR技术建立2010年，其发展十分迅速，应用日趋多元化，由PCR技术衍生的多种相关技术近年广泛应用于病原体的诊断与检测。1.1多重PCR技术1988年由Chamberian等山首先提出这一-概念。多重PCR(mutiplexPCR)是在普通PCR基础上发展起来的，是在同一PCR体系里加上〉2对引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定分型。多重PCR不仅有普逋PCR的特异性和灵敏度，而且更具高效性、系统性、简便经济性。但同时多重PCR也存在不足之处：比如敏感性较低、扩增效率不高、扩增条件需要摸索与协调和引物间干扰等。2007年,刘家云口建立了敏感、特异、快速检测志贺菌属ipall妹因、沙门菌属ipaB基因以及霍乱弧菌EPSM基因的多重PCR方法，对多种病原体DNA的同步快速扩增，可用丁•高危致病菌的早期快速诊断。2008年，Reyes等小利用多重PCR对99例科利儿童的脑脊液样本小易引起急性细菌性脑膜炎的常见致病菌(肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌和流感嗜血菌)进行检测。血培养90例阴性，9例阳性；多重PCR检测结果显示敏感度为89%,特并性为100%，阳性和阴性预期值分别为100%和99%。由此可见，多重PCR方法在检测细菌性脑膜炎的常见的3种致病菌的检测小是一-种快速可靠的方法。2009年,Schmitz等⑷用多重PCR技术建立了一种快速高效的描定7种高危人乳头状瘤病毒(IIPV)基因型方法，并仇达到了定量的检测，同时也解释了病毒不同基因型感染的持续时间、病毒载屋的动力学和疾病重现性3个间题。1.2实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系小加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定最分析的方法。研究表明，每个模板的a值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多G值越小。因此,只要获得位辻样本的Ct值，即可从标准曲线上获得该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR实现了核酸检测的快速性，其荧光探针标记特定核酸的方法使准确性更高，使用更少的样本量并在约1h出结果，简化了传统PCR方法和试验步骤。但也存在容易受核酸污染影响等问题。2005年，冯燕等151建立了以特异性荧光探针为特点的实时PCR方法，用于SARS病毒核酸的检测。这种TaqMan荧光定最PCR方法检测该病毒具有高度特显性，与其他呼吸道病毒均无交叉反应，检测灵敏度达0.1TCID50,所需时间短，从病毒核酸提取到检测完成需约3h,且重现性好。2007年,Yang等⑴利用基于SYBR荧光染料的实时PCR方法直接检测人类粪便中的福氏志贺菌virA基因和鼠伤寒沙收稿日期：2011-04-10；修回日期：2011-05-20基金项目：国家自然科学基金(30927002,30901388,30672004)全军医药卫生科研妹金(066073,086089)国家计生委课题(2009>GJKJS017019)国家传染病重大专项分题(2008ZX10003-02.2008ZX10003-012)通讯作者:府伟灵,E-mail:weilingfu@yahoo,com门菌invA基因，检测最低限分别为1x10CFU/g和2x10CFU/go该方法简单、快速、灵敏、特异而不需要提前进行DNA纯化。2008年,Lehmann等门】建立了一种新的多重实时定屋PCR方法，同时检测25...