1miR-181a-5p在非小细胞肺癌中的功能研究[摘要]目的探索miR-181a-5p的抑癌机制，并探讨它作为标志物用于检测肺癌细胞的可行性。方法：采用CCK8（CellCountingKit-8）方法和流式细胞术分别检测细胞增殖情况和细胞凋亡情况;蛋白质印迹技术检测miR-181a-5p对靶蛋白表达的影响；细胞划痕和Transwell实验检测miR-181a-5p对细胞株的运动抑制；利用双荧光报告基因实验对靶基因进行验证。结果：结果显示miR-181a-5p抑制可A549细胞株的增殖，并且促进细胞的早期凋亡；A549细胞的运动受到miR-181a-5p显著的抑制；miR-181a-5p直接作用于靶基因的3′UTR行使调控。结论：miR-181a-5p可显著抑制NSCLC(non-smallcelllungcancer)细胞生物进程，发挥抑癌基因的作用。[关键词]miR-181a-5p；增殖；迁移；凋亡；非小细胞肺癌[][文献标识码]AnalysisofmiR-181a-5pfunctioninNon-smallcelllungcancer[Abstract]ObjectiveTheaimsofthisstudyweretoexplorethebiologicfunctionsinNSCLCofmiR-181a-5pandtoinvestigatewhetheritcanbeamarkerfordetectingNSCLC.Methods1.Toexaminethecellgrowthandapoptosis,CCK8andflowcytometrywereapplied,respectively.2.TodeterminetheexpressioneffectsofmiR-181a-5p,westernblotblotwasused.3.Transwellassayandwoundhealingassay.4.Plasmidconstructsandluciferasereporterassay.Results1.miR-181a-5pinhibitedcellproliferationandpromotedcellapoptosisinvitro.2.TranswellassayandwoundhealingassayshowedthatmiR-181-5pnegativelyregulatedcellmigrationinvitro.3.miR-181a-5pdown-regulatedKrasexpressionbydirectlytargetingits3′-UTR5.KrasisinverselycorrelatedwithmiR-181a-5pexpressioninNSCLC.ConclusionmiR-181a-5pmightprovideapotentialtreatmentapproachforNSCLCpatients.[Keywords]miR-181a-5p;Proliferation；migration;apoptosis;nonsmallcelllungcancer恶性肿瘤为全球较大的公共卫生问题之一，给人类的身心健康带来了极大的危害，并将在新世纪成为威胁人类生命的第一大杀手[1-2]。在肿瘤的发生发展过程中，miRNA通过调控基因表达影响细胞功能，起抑癌或促癌作用。起抑癌作用的miRNA主要通过调控功基因来抑制细胞的增殖、迁移或促进细胞的凋亡来抑制肿瘤的发生[3-4]1材料与方法1.1实验材料非小细胞肺癌细胞株SPCA-1购自ATCC；非小细胞肺癌细胞株A549购自中科院生化细胞所细胞库。1.3实验方法1（1）细胞培养：非小细胞肺癌细胞株A549、SPCA-1分别培养在含有10%胎牛血清、青霉素105IU/L、链霉素100mg/L的1640和DMEM培养基中，培养基于37℃，CO2体积分数为5%的细胞培养箱内培养。细胞融合到85%左右时，用0.25%胰酶消化，传代[9]。。（2）细胞增殖实验[5]：取对数生长期的细胞，以1×104个/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔接种100μL，培养待细胞贴壁后，再分别加入miR-181a-5p、anti-miR-181a-5p，每组设置6个复孔，同时设置不受处理因素的对照组（NC），也设置6个复孔。分别培养24h和48h后，每孔加入25μL的MTT噻唑蓝，继续培养4h后小心弃去培养液，再每孔加入150μL的DMSO，于摇床上振摇10min，充分溶解生成的结晶，然后于490nm波长处测定各组的光吸收值（OD值），重复3次，取均值。用下面的公式计算各组药物的细胞的抑制率[10-11]：抑制率=(1-药物组OD值/对照组OD值)×100％（3）流式细胞仪检测[6]按照流式细胞仪检测细胞凋亡试剂盒操作，以适量的胰酶消化、收集转染后的A549细胞，磷酸盐缓冲液洗涤、重悬细胞，2000r/min5min收集（1×105）-（5×105）个细胞，离心沉淀，加入500ulBindingBuffer重悬细胞，向重悬液中加入5ulAnnexinV-FITC染色，随后加入5ulPI染色，室温下避光孵育15min，流式细胞仪检测凋亡率，实验重复3次。（4）miR-181a-5p靶基因的鉴定[7]从A549细胞中提取总RNA，并反转成cDNA后用来作为PCR的模板，成功的得到了5种靶基因的目的片段。经割胶回收后，在37℃用相适应的限制性内切酶酶切2h后，用T4DNA连接酶16℃连接过夜后，转化TOP10大肠杆菌感受态细胞。挑取单克隆经扩大培养后，提取质粒，送至上海英俊生物公司测序。经序列比...