重组美洲钩虫天冬氨酸蛋白酶Na・APR・l放大培养条件的研究梁秋菊，黄金蓉，王瑾雯，邓日强，王殉章（中山大学生命科学学院，广州510275）摘要：对组成型表达的重组美洲钩虫天冬氨酸蛋白酶的毕赤酵母菌株的发酵培养基以及发酵条件进行研究，并在5L的发酵罐上进行放大发酵试验。确定优化后的培养基为：甘汕5%,NH4H2PO41.5%,MgSO414.9g/L,CaCh0.53g/L,k：SO418.2g/L,KH2PChO」％,K2HPO40.25%和PTM14.35mL/L。确定最佳培养条件为：种龄为24h,接种量为8%,温度为28°C,pH为5.5。重组美洲钩虫天冬氨酸蛋白酶在优化后的培养棊的表达量约为Invitrogen公司建议的BSM培养棊的两倍。在摇瓶培养结果的棊础上，在5L的发酵罐上进行放大发酵试验。其中66h时OD600为240,湿菌重为264g/L,Na-APR-1蛋白表达量最高约为40mg/L,高于优化后培养基在摇瓶的表达量约30关键词：Na-APR-1；毕赤酵母；优化：TQ92Studyonthescale-upcultureconditionofrecombinantNecatoramericanusasparticprotease,Na-APR-1LIANGQiuju,HUANG激nrong,WANG激nwen,DENGRiqiang,WANGXunzhang（LifeScienceSchool,SunYat-SenUniversity,GuangZhou510275）Abstract:TheoptimumfermentationmediumandconditionofreconibinantPichiapastorisweresludied.BasedonlheresultsatshakeHaskslevel,scaleupstudieswerecaiTiedoutin5Ltermentor.Theoptimalfermentationmediumwasdeterminedasfollows:glycerol5%,NH4H2PO41.5%,MgSO414.9g/L,CaCh0.53g/L,kzSCh18.2g/L,KH2PO40」%,K2HPO40.25%andPTM14.35mL/LoTheoptimumcultureconditionsinclude:lheoptimalseedgrowthtimewas24h,seedvolumewas8%,temperaturewas28°CandpHwas5.5。Underthisoptimizedmediumandcultureconditions,In5Lfermenlor66hOD600was240,celldryweightwas264g/L,lheconcentrationofNa-APR-1was40mg/L,whichwashigherthanhakeflasks'fermentationyield30mg/L.Keywords:Na-APR-1;Pichiapastoris;optimization0引言钩虫感染可导致宿主产生严重的缺铁性贫血，已被公认为全球最重要的人类肠道病原寄生虫之一。全球大约有5.76亿人感染钩虫，主要流行于撒哈拉以南之非洲地区、东南亚、中国和拉丁美洲［1］。山于钩虫对宿主存在明显的免疫抑制和潜在的耐药性，迫切需要找到一种替换或补充的方法來实现对这一问题的控制。研制和使用抗钩虫疫苗就是一个有应用前景的途径［2］。美洲钩虫天冬氨酸蛋白酶N/APR-1能够刺激人体免疫体统产生特异性抗体抑制寄生虫吸血，也证实了对钩虫成虫有特异的防护作用［3］。本试验对组成型表达的重组美洲钩虫天冬氨酸蛋白酶的毕赤酵母菌株的发酵培养基以及发酵条件进行研究，目的是提高重组毕赤酵母菌株的表达量，为大观模生产奠定基础。基金项目：陳士点基金资助（200805580033）作者简介：梁秋菊，（1985），女，硕士研究生，现代生物医药工程。・通信联系人：王瑾雯，（1969・），女，副教授，基因调控和表达。E-mail:wang激nw@mail.sysu.cdu1材料与方法1.1供试菌株P.pastorisX33菌株，载体pGAPZaA,外源基因为美洲钩虫天冬氨酸蛋白酶M/-APR-1。(由GeorgeWashingtonUniversity和SabinVaccineInstitute构建)。1.2培养基1.2.1种子培养基YPD培养皋(葡萄糖2%,蛋白豚2%,酵母提取物1%),pH自然1.2.2发酵棊础培养基甘油5%,NH4H2PO41.5%,MgSO414.9g/L,CaCli0.53g/L,loSChl2g/L,KH2PO40.1%,IGHPOjO.25%和PTMi4.35mL/L0PTMi配方见［4］。1.2.35L发酵罐培养基甘油4%,NH4H2PO41.5%,MgSO414.9g/L,CaSCh0.93g/L,K2SO418.2g/L,0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=6:0),PTMi4.35mL/Lo补料：5()%葡萄糖，12mL/LPTMi1.3培养方法1.3.1种子复苏方法取一支・80C甘油保存的重组美洲钩虫天冬氨酸蛋白酶工程菌，在YPD液体培养基中培养12小时，取菌液在YPD(含Zeocin™lOOpg/ml)琼脂平板上划线分离单菌落。28°C恒温培养箱倒置培养72小时。1.3.2种子培养基的摇瓶培养法从酵母平板上挑一单菌落，接入到装5()mlYPD液体培养基的3()()ml三角瓶中，28°C,220rpm振荡培养30小时，作为接种发酵培养基的种子液。133发酵培养基的摇瓶法将培养好的种子液以1()%接种量接种到装20ml发酵培养基250ml三角瓶中...